?；撬釋?duì)高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

呂雨杰,賈 晗,梁 亮,羅宗剛,2,蒙 燦,劉菲菲,張龔偉,2,左福元,2,王 玲,2*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,重慶 榮昌402460;2.重慶市肉牛工程研究中心,重慶 榮昌,402460)

在現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展中,奶牛養(yǎng)殖最容易受到全球變暖和氣候變化的影響[1]。高溫條件下,奶牛會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng),不僅會(huì)使其采食量下降、牛奶產(chǎn)量降低,還會(huì)損害奶牛的健康[2-3]。熱應(yīng)激作為一種主要的環(huán)境應(yīng)激源,給奶牛業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)。乳腺上皮細(xì)胞是參與奶牛泌乳中最重要的一種細(xì)胞,產(chǎn)奶量可隨著泌乳高峰期后乳腺組織中上皮細(xì)胞數(shù)量的減少而減少。在高溫環(huán)境條件下,乳腺上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡,這種凋亡與產(chǎn)奶量的下降密切相關(guān)[4-5]。

?；撬?taurine,Tau)是一種β-氨基乙磺酸,以游離狀態(tài)存在于動(dòng)物組織中,具有抗細(xì)胞凋亡和許多藥理功能[6-7]。YANG等[8]研究發(fā)現(xiàn),牛磺酸可以抑制由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞基質(zhì)的過度降解來保護(hù)髓核細(xì)胞。SUN等[9]研究結(jié)果顯示,牛磺酸通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路減輕大鼠由丙烯酰胺引起的細(xì)胞凋亡。在熱應(yīng)激狀態(tài)下,?；撬峋哂刑岣呒仪莸臒釕?yīng)激適應(yīng)性、抗炎、抗氧化及改善生產(chǎn)性能等功能[10]。MA等[11]研究表明,在熱應(yīng)激條件下,肉雞飼料中補(bǔ)充?；撬?可以顯著抑制PERK信號(hào)傳導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)分解,從而改善慢性熱應(yīng)激引起的肉雞肌肉損失和肌肉質(zhì)量下降。?；撬崾欠衲芫徑鉄釕?yīng)激引起的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡目前報(bào)道很少,本試驗(yàn)在高溫條件下不同濃度牛磺酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響,為探究?；撬釋?duì)奶牛熱應(yīng)激調(diào)控的分子機(jī)理以及緩解奶牛熱應(yīng)激、維持奶牛乳腺泌乳能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑實(shí)驗(yàn)室利用荷斯坦牛分離培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞;胎牛血清、DMEM/F12完全培養(yǎng)基購自Gibco公司;?；撬?Taurine,純度>99%)購自麥克林公司;D2000 DNA Marker、Total RNA Extraction Kit、瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司;SuperReal 彩色熒光定量預(yù)混試劑盒購自天根生化科技有限公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購自碧云天公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)購自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理將奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后細(xì)胞分別接種于12孔板、24孔板和96孔板,當(dāng)細(xì)胞密度為60%～70%時(shí)更換為含0,8,32,128,256 mmol/L牛磺酸的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)6 h后轉(zhuǎn)移至42℃培養(yǎng)6 h,其中0 mmol/L 處理組為對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)按照CCK8檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力及增殖水平檢測(cè)。在高溫處理后的96孔板的細(xì)胞中,每孔加入10 μL的CCK-8溶液,在37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)使用Annexin V-FITC試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè):取出添加牛磺酸高溫處理后的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基, PBS洗滌后加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液;加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻;加入10 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻;室溫避光孵育15 min后進(jìn)行冰浴,隨即在熒光顯微鏡下觀察,Annexin V-FITC為綠色熒光,碘化丙啶(PI)為紅色熒光。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.5.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中牛的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2基因及內(nèi)參基因β-Actin的mRNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的上、下游引物,引物由金唯智生物科技有限公司合成,基因引物信息見表1。

表1 引物詳細(xì)信息表

1.5.2總RNA提取與cDNA的合成 使用總RNA提取試劑盒對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA進(jìn)行抽提,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成cDNA。

1.5.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR?Green Ⅰ染料法,參照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR,檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量。反應(yīng)體系為:cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL,2×SuperReal Color PreMix 5 μL,ddH2O 3.2 μL。熒光定量PCR的反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性 30 s;95℃變性10 s,60℃退火30 s,共39個(gè)循環(huán),隨后進(jìn)行熔解曲線分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞增殖使用以下公式計(jì)算:細(xì)胞活力=[D處理-D空白]/[D對(duì)照-D空白]×100%;熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析,通過IBM SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”對(duì)細(xì)胞增殖及熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行差異性分析,用Graphpad Prism 8.0作圖,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 牛磺酸對(duì)高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響利用CCK-8試劑盒檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖情況,從圖1可以看出,在高溫條件下,8,32,128 mmol/L?；撬崽幚斫M的奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其中添加32 mmol/L?；撬釋?duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖最為顯著(P<0.05);在高溫條件下,256 mmol/L?；撬崽幚斫M和對(duì)照組相比乳腺上皮細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。

不同小寫字母間表示差異顯著(P<0.05);相同小寫字母間表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 牛磺酸對(duì)高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)高溫條件下?；撬崽幚淼哪膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè),結(jié)果顯示,在高溫條件下,與對(duì)照組相比,8,32 mmol/L處理組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的數(shù)量呈下降趨勢(shì),呈現(xiàn)壞死的細(xì)胞數(shù)量變化不明顯;添加128,256 mmol/L牛磺酸處理組的凋亡細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加,256 mmol/L的?；撬嵋种屏思?xì)胞的增殖,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,凋亡和壞死的細(xì)胞顯著增加,說明高濃度?；撬崽幚頃?huì)促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡(圖2)。

綠色熒光為凋亡細(xì)胞,綠色和紅色熒光雙染的為壞死細(xì)胞,未被熒光染色的為正常細(xì)胞

2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)不同濃度?；撬釋?duì)高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量見圖3。從圖中可以看出,高溫條件下,奶牛乳腺上皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax基因的表達(dá)量隨牛磺酸濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。其中,Caspase-3基因表達(dá)量在32,128,256 mmol/L處理組與對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05),在32 mmol/L處理組表達(dá)量最低;Caspase-8基因表達(dá)量在0～128 mmol/L處理組間差異不顯著(P>0.05),256 mmol/L處理組較對(duì)照組顯著升高(P<0.05);Caspase-9基因在8,32,256 mmol/L處理組的表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著(P<0.05);Bax基因表達(dá)量在各處理組和對(duì)照組差異顯著(P<0.05),8,32,128 mmol/L處理組間基因表達(dá)差異不顯著(P>0.05);抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)量隨?；撬釢舛鹊脑黾映尸F(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在32 mmol/L處理組的表達(dá)量顯著高于其他處理組(P<0.05);Bax/Bcl-2基因表達(dá)量比值在8,32,128 mmol/L處理組與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05),256 mmol/L處理組的比值較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。

圖3 ?；撬釋?duì)高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3 討論

在高溫條件下,當(dāng)動(dòng)物總的熱負(fù)荷超過了它的散熱能力,就會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài),從而產(chǎn)生一系列生理和行為反應(yīng)以減少機(jī)體壓力。由環(huán)境引起的熱應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降,給全球畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物調(diào)節(jié)體溫的能力與物種及品種有關(guān),奶牛通常比肉牛品種對(duì)熱更敏感,更容易受到熱應(yīng)激的影響[12]。高溫引起的熱應(yīng)激在一定程度上會(huì)擾亂細(xì)胞內(nèi)自由基的穩(wěn)定,導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體氧化損傷[13]。作為參與乳汁合成過程中最重要的泌乳細(xì)胞,即乳腺上皮細(xì)胞,其質(zhì)量和數(shù)量在一定程度上決定奶牛的產(chǎn)奶量,并在乳腺發(fā)育和泌乳過程中不斷增殖和分化[14]。

牛磺酸在動(dòng)物的腦、心臟、肝臟、腎臟及骨骼肌中表達(dá)豐富,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、抗氧化、能量代謝等方面具有重要作用[15-16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),奶牛乳腺上皮細(xì)胞在高溫條件下,添加8,32 mmol/L的?；撬崮軌蛱岣呒?xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞凋亡水平,說明牛磺酸能有效緩解高溫環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。大量研究表明,牛磺酸可以作為抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,具有保護(hù)細(xì)胞膜和抗炎的功能,有效減輕哺乳動(dòng)物細(xì)胞炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,在將應(yīng)激所引起各種疾病嚴(yán)重程度最小化方面發(fā)揮著重要作用[17-18]。

熱應(yīng)激具有細(xì)胞毒性,可引起活性氧(ROS)和活性氮自由基的產(chǎn)生,導(dǎo)致氧化損傷。為應(yīng)對(duì)來自內(nèi)部和外部環(huán)境的有害刺激,機(jī)體通過調(diào)節(jié)代謝反應(yīng),激活凋亡通路以維持細(xì)胞穩(wěn)定[19]。研究發(fā)現(xiàn),?；撬峥赏ㄟ^減少ROS的形成和減少凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來防止高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。本試驗(yàn)中RT-PCR結(jié)果顯示,添加不同濃度的?；撬崾垢邷貤l件下的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bax基因mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì),Bcl-2基因mRNA表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9是Caspase家族的重要成員,在凋亡信號(hào)通路和其他生物學(xué)功能扮演著關(guān)鍵角色。Caspase-3是效應(yīng)型Caspases,是凋亡的執(zhí)行者,負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡的形態(tài)和生化特征改變。Caspase-8、Caspase-9是啟動(dòng)型Caspases,細(xì)胞凋亡是否啟動(dòng)受Caspase-8、Caspase-9的酶原是否激活而調(diào)控。啟動(dòng)型Caspases通過與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)相互作用被激活,從而激活效應(yīng)型Caspases[21-23]。本試驗(yàn)中添加32 mmol/L牛磺酸降低了乳腺上皮細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9基因的表達(dá),表明高溫條件下?；撬嵋种屏巳橄偕掀ぜ?xì)胞內(nèi)源性凋亡基因Caspase-9的表達(dá),從而使效應(yīng)型Caspase-3不能被激活,減少了高溫引起的細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞凋亡過程中,促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2是Bcl-2家族中最重要的一對(duì)相互對(duì)立的基因,且Bax可激活Bcl-2的活性,Bcl-2家族基因在接收凋亡信號(hào)后,Bcl-2與Bax在體內(nèi)結(jié)合為二聚體,Bax/Bcl-2比值決定著細(xì)胞凋亡的走向[24]。高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞中添加8,32,128 mmol/L?；撬酈ax基因表達(dá)顯著下調(diào),32 mmol/L 組中Bcl-2基因表達(dá)量顯著上調(diào),8,32,128 mmol/L處理組中Bax/Bcl-2比值顯著降低,證明牛磺酸促進(jìn)了抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),抑制了凋亡基因Bax的表達(dá),從而有效抑制由高溫引起的乳腺上皮細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2通過Caspase-9和Caspase-3依賴性途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)刺激線粒體釋放細(xì)胞色素c,細(xì)胞色素c與Apaf-1、ATP和ProCaspase-9相互作用組裝出細(xì)胞凋亡體,激活Caspase-9的表達(dá),從而使Caspase-3活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。本試驗(yàn)中,高溫條件下添加256 mmol/L?；撬釋?dǎo)致凋亡相關(guān)基因表達(dá)顯著升高,大量乳腺上皮細(xì)胞死亡,細(xì)胞數(shù)量減少。BAI等[26]研究結(jié)果顯示,當(dāng)細(xì)胞中?；撬釢舛冗_(dá)到200 mmol/L左右時(shí),細(xì)胞凋亡增加,本試驗(yàn)的結(jié)果與此一致,其可能的原因是過多的?；撬釙?huì)產(chǎn)生毒性,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至進(jìn)一步壞死。

綜上所述,一定濃度的?；撬峥梢酝ㄟ^影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡途徑中的相關(guān)基因參與高溫誘導(dǎo)引發(fā)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程,有效緩解由于高溫環(huán)境所引起的奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷,從而抵抗細(xì)胞增殖受阻和細(xì)胞凋亡。牛磺酸可以通過降低細(xì)胞凋亡率保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞,以維持乳腺合成和儲(chǔ)存乳汁的能力。