核酸適配體熒光探針法和液基夾層杯法檢測結(jié)核分枝桿菌臨床應(yīng)用價值比較

徐镠粵 廖慶華 彭柯皓 余美玲 陳燕梅 卓文基 賴曉宇

（廣東省結(jié)核病控制中心，廣東 廣州 610630）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病，嚴(yán)重危害公共健康，患者除頭發(fā)、指甲外，全身各個器官和系統(tǒng)均可受累，以肺部感染為主。據(jù)《全球結(jié)核病報告》[1]顯示，2020年全球新發(fā)結(jié)核病病例987萬例，較往年有所緩解；我國作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，僅次于印度，發(fā)病例數(shù)居全球第二位（8.5%），原因主要是新型結(jié)核病診斷技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用進度緩慢，新型抗結(jié)核藥物匱乏。目前，結(jié)核病的微生物學(xué)診斷方法有抗酸染色鏡檢、MTB分離培養(yǎng)和體外藥物敏感性試驗等，其中抗酸染色鏡檢是我國基層結(jié)核病實驗室診斷結(jié)核病的重要方法，也是較為經(jīng)濟的選擇，但其影響因素較多，敏感性較差，部分感染患者不能被及時發(fā)現(xiàn)。因此，開發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡便、低成本的結(jié)核病實驗室診斷方法非常重要。

核酸適配體是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA），是從1個體外合成的隨機寡核苷酸文庫中，通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選到的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子單鏈DNA或RNA片段[2]。適配體具有可體外人工合成、高特異性、高親和力、高敏感性，以及作用的靶分子范圍極廣等特點[3]。本研究中的核酸適配體熒光探針法是廣東省結(jié)核病控制中心和有關(guān)企業(yè)共同研發(fā)的一種新的MTB鏡檢方法，目前尚處于實驗階段。液基夾層杯法與傳統(tǒng)的抗酸染色鏡檢法最大的區(qū)別在于具有消化富集特點，能夠有效提高檢出率[4]。本研究擬評估液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針法在臨床診斷結(jié)核病中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2 0 2 1年3-5月東莞市第六人民醫(yī)院175例臨床確診為肺結(jié)核的住院患者（肺結(jié)核組），其中男1 0 3 例、女7 2 例，年齡（43.6±10.3）歲。另選取80名健康體檢者為對照組，其中男46名、女34名，年齡（40.8±9.6）歲。留取所有研究對象3份痰液樣本（清晨痰、即時痰和夜間痰，均為用藥前留?。?，將3份痰液樣本混勻后，分別用液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法、液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針法進行檢測。肺結(jié)核診斷符合《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2017）》要求[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）長期接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療；2）伴心臟、肝臟、腎臟疾??；3）惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)廣東省結(jié)核病控制中心倫理委員會批準(zhǔn)（20211129），所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng)法

將痰液樣本用NALC-NaOH混合溶液（批號C12157777，上海麥克林生化科技有限公司）消化離心后，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（批號112520210408，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）重懸，加入含有MGIT PANTA和MGIT生長添加劑（批號1042610，美國BD公司）的培養(yǎng)管中，使用BACTECTM MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)（美國BD公司）進行培養(yǎng)。培養(yǎng)陽性結(jié)果系統(tǒng)直接報告；培養(yǎng)陰性，42 d（6周）后報告結(jié)果。

1.2.2 固體培養(yǎng)法

將痰液樣本用4%氫氧化鈉消化15 min，接種于羅氏固體培養(yǎng)基（批號20211122，珠海貝索生物技術(shù)有限公司），于37 ℃溫箱中孵育，持續(xù)觀察菌株生長情況，如56 d（8周）后培養(yǎng)基無菌落生長，則報告為陰性。

1.2.3 液基夾層杯法

將痰液樣本用消化液（批號201201，湖南天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)股份有限公司）充分混勻后放置30～60 min，至消化完全。取2 mL消化好的樣本，加入已預(yù)熱濕膜后的夾層杯中，使用痰自動涂片染色機（湖南天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)股份有限公司）進行抗酸染色，烘干，油鏡下觀察。

1.2.4 核酸適配體熒光探針法

將痰液樣本用4%氫氧化鈉消化15 min，加入蛋白酶K溶液，酶解后離心去上清，加入核酸適配體熒光探針，磷酸鹽緩沖液溫和振蕩孵育后離心去上清，用磷酸鹽緩沖液重懸，涂片鏡檢。MTB鏡下呈現(xiàn)桿狀綠色熒光（圖1）。

圖1 核酸適配體熒光探針法陽性涂片

1.2.5 抗酸染色鏡檢法

將痰液樣本直接涂布于載玻片上，用抗酸染色液（批號C210401，珠海貝索生物技術(shù)有限公司）進行染色，自然干燥，油鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kappa一致性檢驗進行一致性分析，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，R O C）曲線評價核酸適配體熒光探針法診斷肺結(jié)核的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核組和對照組5種方法檢測結(jié)果

對照組中，抗酸染色鏡檢法和核酸適配體熒光探針法分別檢出1例和3例陽性，其他方法均為陰性。5種方法檢測結(jié)果見表1。

表1 肺結(jié)核組和對照組5種方法檢測結(jié)果 例

2.2 核酸適配體熒光探針法診斷價值

以液體培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn)，核酸適配體熒光探針法的敏感性為54.79%、特異性為50.98%、準(zhǔn)確度為52.57%、陽性預(yù)測值為44.44%、陰性預(yù)測值為61.68%。一致性分析結(jié)果顯示，核酸適配體熒光探針法與液體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法一致性較差（P＞0.05）；見表2、表3。ROC曲線分析結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)法為參考，核酸適配體熒光探針法診斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.529，95%可信區(qū)間為0.442～0.616，P=0.515；以抗酸染色鏡檢法為參考，核酸適配體熒光探針法診斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.506，95%可信區(qū)間為0.420～0.591，P=0.899。

表2 核酸適配體熒光探針法與液體培養(yǎng)法比較 例

表3 核酸適配體熒光探針法與抗酸染色鏡檢法比較例

2.3 液基夾層杯法診斷價值

以液體培養(yǎng)法結(jié)果為參考，液基夾層杯法的敏感性為78.08%、特異性為98.04%、準(zhǔn)確度為89.71%、陽性預(yù)測值為96.61%、陰性預(yù)測值為86.21%。一致性分析結(jié)果顯示，液基夾層杯法與液體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法一致性較好（P＜0.001）。見表4、表5。

表4 液基夾層杯法與液體培養(yǎng)法比較 例

表5 液基夾層杯法與抗酸染色鏡檢法比較 例

ROC曲線分析結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)法為參考，液基夾層杯法診斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.881，95%可信區(qū)間為0.821～0.940，P＜0.001；以抗酸染色鏡檢法為參考，液基夾層杯法斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.792，95%可信區(qū)間為0.711～0.874，P＜0.001。

3 討論

結(jié)核病是全球十大致死性疾病之一，盡管不斷有新的診斷方法、藥物和疫苗被開發(fā)出來，但結(jié)核病仍是威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病的檢測方法很多，痰涂片抗酸染色鏡檢簡單、快速、經(jīng)濟，是最常用的方法，特別是在欠發(fā)達地區(qū)[6]；培養(yǎng)法作為公認(rèn)的診斷結(jié)核病的病原學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)，具有高敏感性和特異性，但耗時較長[7]；液基夾層杯法是國家科技重大專項成果，作為結(jié)核病診斷的新技術(shù)，具有生物安全性高和陽性檢出率高的特點[4]；近年來，國內(nèi)外關(guān)于適配體的研究發(fā)展迅速，已成功篩選到多種MTB適配體用于結(jié)核病的診斷和鑒別，其檢測敏感性和特異性明顯高于傳統(tǒng)方法[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但固體培養(yǎng)法操作簡單，成本低，可以直接判斷是否存在污染，更適合基層實驗室開展；液體培養(yǎng)法則更為快速、準(zhǔn)確[8]?；诖?，本研究以液體培養(yǎng)法為參考，比較液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針法的一致性。借鑒培養(yǎng)法對樣本的消化預(yù)處理是液基夾層杯技術(shù)的主要創(chuàng)新點，結(jié)合充分震蕩，使痰液樣本完全液化，有利于抗酸桿菌在特殊底膜上沉淀，然后染色讀片。該技術(shù)相較于傳統(tǒng)涂片染色，陽性率有極大的提高[9]，并有效避免了生物安全風(fēng)險。本研究發(fā)現(xiàn)，液基夾層杯法敏感性、特異性、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值與已有研究結(jié)果[10]一致，各項指標(biāo)優(yōu)于抗酸染色鏡檢法，且液基夾層杯法與液體培養(yǎng)法一致性較好。本研究有2例液基夾層杯法陽性、液體培養(yǎng)法陰性的樣本，可能與患者服用過抗結(jié)核藥物有關(guān)?？菇Y(jié)核藥物治療后，患者體內(nèi)MTB活性降低，排菌減少，從而可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)涂片陽性、培養(yǎng)陰性[11]。

適配體是單鏈DNA或RNA寡核苷酸，能夠與靶分子結(jié)合，具有很高的特異性和親和力，因此，適配體被用于診斷、生物傳感器和靶向治療，被認(rèn)為是酶聯(lián)免疫吸附試驗中抗體的替代品[12]。目前已研發(fā)出多種應(yīng)用于MTB診斷的適配體，如分泌蛋白MPT64、CFP-10、ESAT6，作為靶物質(zhì)的適配體，在MTB診斷上均有重大突破[2]。本研究采用了一種新型適配體技術(shù)--核酸適配體熒光探針法檢測MTB，結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)法為參考，核酸適配體熒光探針法敏感性為54.79%，這與成熟的液基夾層杯法和培養(yǎng)法的結(jié)果有較大差異；在陰性對照組中，有3例被判斷為陽性；經(jīng)Kappa一致性分析和ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)核酸適配體熒光探針法與液體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法的一致性均較差。有研究發(fā)現(xiàn)，在篩選核酸適配體的過程中，一些適配體的結(jié)合可能會因競爭相同的結(jié)合位點而被其他抗體抑制；另外，空間位阻和核苷酸長度等也會影響適配體的親和力，這可能是該方法診斷價值不高的原因之一[13]?；诤怂徇m配體的優(yōu)化，可以通過位點序列的優(yōu)化或從動力學(xué)上改善核酸適配體，從而提高其診斷MTB感染的價值[14]。

本研究樣本量較少，結(jié)論具有一定局限性，需要進一步研究結(jié)果加以驗證。

綜上所述，液基夾層杯法在結(jié)核病診斷中的價值較高，核酸適配體熒光探針技術(shù)尚需進一步優(yōu)化。