非小細(xì)胞肺癌患者血漿EGFR基因c.2572_2573delinsAG位點(diǎn)突變1例報(bào)道

陳馨寧 黃 斐 姜惠琴 沈敏娜 潘柏申 王蓓麗 郭 瑋

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

使用血液樣本進(jìn)行血漿表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因檢測(cè)已經(jīng)成為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）臨床診療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。本研究報(bào)道1例EGFR：c.2572_2573delinsAG陽(yáng)性NSCLC患者，采用改進(jìn)的突變擴(kuò)增阻礙系統(tǒng)（super amplification refractory mutation system，Super-ARMS）檢測(cè)血漿循環(huán)游離DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），未檢出該突變；采用抑制探針置換擴(kuò)增（blocker displacement amplification，BDA）法檢出該突變位點(diǎn)。

1 病例資料

1.1 簡(jiǎn)要病史

患者，男，87歲，發(fā)現(xiàn)肺部惡性腫瘤1年，因無(wú)癥狀未行治療，2020年11月31日主訴“近期胸痛、吞咽困難”就診。2020年12月1日行單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)/電子計(jì)算機(jī)斷層掃描顯像結(jié)合全身骨平面顯像，考慮為全身多處骨轉(zhuǎn)移。

1.2 血漿EGFR基因檢測(cè)結(jié)果

采集患者靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用兩步離心法，4 ℃ 1 600×g離心10 min，分離血漿，4 ℃ 16 000×g再次離心10 min，吸取上清4 mL，采用核酸提取試劑（廈門艾德生物醫(yī)藥公司）抽提ctDNA，分別采用Super-ARMS和BDA法檢測(cè)。Super-ARMS試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，BDA法試劑盒購(gòu)自上海閱爾基因技術(shù)有限公司，檢測(cè)儀器均為7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

血漿EGFR基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。Super-ARMS未檢出EGFR突變，BDA法檢出EGFR基因21號(hào)外顯子L858R突變，位點(diǎn)為c.2572_2573delinsAG，該位點(diǎn)不在Super-ARMS檢測(cè)范圍內(nèi)。

圖1 患者血漿EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果

隨后使用Sanger測(cè)序[委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行，上游引物為5'-GCTCCCAGTACCTGCTCAAC-3'，下游引物為5'-TGATAGGCACTTTGCCTCCT-3']和二代測(cè)序[試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，檢測(cè)儀器為 MiSeq測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）]進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果同BDA法。同時(shí)，為避免存在克隆造血影響，對(duì)患者基因組DNA中該位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為陰性。

2 討論

Super-ARMS技術(shù)基于ARMS，是腫瘤相關(guān)分子檢測(cè)的主要技術(shù)之一，檢測(cè)下限為0.2%～0.8%[2-3]。基于該技術(shù)的EGFR試劑盒是中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局首次按照伴隨診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)審評(píng)并批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品。BDA法是基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的突變富集技術(shù)，在野生型DNA背景下選擇性地?cái)U(kuò)增基因突變，利用引物和抑制探針之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系提高PCR的效率和低豐度突變檢出率，檢測(cè)下限為0.01%～0.10%[4]。

基于特定突變位點(diǎn)探針和引物的PCR方法只能檢測(cè)有限數(shù)量和已知的特異性突變，而測(cè)序可以揭示所有分析序列中的異常，包括罕見(jiàn)和未知突變，見(jiàn)圖2。由于Sanger測(cè)序靈敏度相對(duì)較低（10%），因此采用BDA技術(shù)補(bǔ)充檢測(cè)EGFR第18～21號(hào)外顯子全部突變，具有在常規(guī)EGFR基因突變基礎(chǔ)上獲得更多臨床和科研價(jià)值[5]的優(yōu)勢(shì)。

圖2 3種檢測(cè)方法原理

EGFR基因與腫瘤的發(fā)展、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，根據(jù)EGFR基因突變結(jié)果指導(dǎo)NSCLC患者進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐方法[1]。然而，臨床診療過(guò)程中肺癌組織受檢率并不高，導(dǎo)致基于驅(qū)動(dòng)基因突變靶點(diǎn)的個(gè)體化治療策略難以實(shí)施。多項(xiàng)回顧性和前瞻性研究結(jié)果均表明，當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，血液ctDNA檢測(cè)是合適的突變分析替代選擇[1]。和傳統(tǒng)活檢相比，液體活檢具有無(wú)創(chuàng)、可實(shí)時(shí)檢測(cè)、克服腫瘤異質(zhì)性等特點(diǎn)。因此，血液EGFR基因突變檢測(cè)的臨床價(jià)值逐漸突顯[6]。

EGFR基因21 號(hào)外顯子L858R 突變占所有突變的32%，常見(jiàn)的突變形式為c.2573T＞G，也有c.2573_2574delinsGT和c.2573_2574delinsGA突變相關(guān)報(bào)道[7]。本例患者檢出的c.2572_2573delinsAG位點(diǎn)也屬于L858R突變，但鮮有報(bào)道。L858R突變患者為EGFR敏感突變，此類患者酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的療效優(yōu)于化療。因此，L858R突變的檢出無(wú)疑增加了患者的治療選擇和機(jī)會(huì)。除了常見(jiàn)突變外，其余突變也可以幫助臨床為患者做出更好的臨床決策。非經(jīng)典突變主要包括G719X（18號(hào)外顯子）、S768I（20號(hào)外顯子）、L861Q（21號(hào)外顯子）突變[8]，目前基本已包括在基于PCR方法的商品化診斷試劑盒的檢測(cè)范圍內(nèi)。但另有罕見(jiàn)突變，如18del、E709X和19ins，其發(fā)生頻率＜0.5%，在非測(cè)序方法中被忽視。E709X對(duì)一代TKI的反應(yīng)介于經(jīng)典EGFR突變和EGFR野生型之間。18del、E709X和19ins均對(duì)二代TKI敏感，但相關(guān)臨床數(shù)據(jù)較少，僅有相關(guān)病例報(bào)道患者治療后獲部分緩解[9]。此外，常見(jiàn)突變類型中特定的突變位點(diǎn)可能對(duì)TKI表現(xiàn)出獨(dú)特甚至相反的選擇性，如EGFR基因第19外顯子缺失中p.L747-A750＞P與其他缺失類型相比，患者接受厄洛替尼治療獲得的臨床結(jié)局更差[10-11]；除p.A763_Y764insFQEA和p.A763_Y764insLQEA外，攜帶EGFR基因第20外顯子插入的患者對(duì)EGFR-TKI治療普遍不敏感[12-13]。因此，更深入、更全面地開展腫瘤分子檢測(cè)可以幫助了解罕見(jiàn)突變?nèi)绾斡绊慐GFR蛋白結(jié)構(gòu)和TKI結(jié)合效力[14-15]，為NSCLC患者提供更有價(jià)值的治療見(jiàn)解，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。