微陣列芯片法和多同源基因序列測序在非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定中的差異

郭明日 李玉明 李 妍 孫海柏

（天津市海河醫(yī)院 天津大學(xué)海河醫(yī)院檢驗科 國家中醫(yī)藥管理局傳染病重點研究室，天津 300350）

非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculousMycobacterium，NTM）可導(dǎo)致人類無癥狀和有癥狀的感染，迄今已分類、鑒定超過200個菌種，準(zhǔn)確、快速地鑒定菌種及其型別，對于NTM感染的診療極為重要[1-3]。依據(jù)生長速度，NTM可分為緩慢生長群和快速生長群兩大類。最常見的具有臨床意義的緩慢生長群包括鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海洋分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、嗜血分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌，快速生長群包括膿腫分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacteriumabscessuscomplex，MABC）、龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌[4-5]。目前，常用的NTM菌種和型別鑒定技術(shù)主要為微陣列芯片、同源基因測序、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、線性探針雜交等[6-9]。微陣列芯片技術(shù)僅能檢測包括NTM在內(nèi)的17種分枝桿菌，線性探針雜交技術(shù)也僅能檢測20種常見的NTM和19種較少見的NTM。質(zhì)譜技術(shù)可檢測的菌種較多，但由于設(shè)備昂貴、數(shù)據(jù)庫中的分枝桿菌菌種有限，且不同分枝桿菌培養(yǎng)物前處理方法差異較大，準(zhǔn)確性受限[10-11]。同源基因測序是分枝桿菌菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用的同源基因序列有16SrRNA、16S～ 23SrRNA基因間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、RNA聚合酶亞基B（subunit of RNA polymerase B，rpoB）、熱休克蛋白 65（heat shock protein 65，hsp65）[7]。MABC是常見的快速生長群菌種，也是天津地區(qū)常見的NTM菌種，采用同源基因序列測序可將其分為MABC膿腫亞種、MABC馬賽亞種和MABCbolletii亞種[7，12-13]。本研究通過比較微陣列芯片技術(shù)和同源序列測序?qū)?70株NTM臨床分離株鑒定結(jié)果的差異，為臨床實驗室選擇合適的檢測方法提供參考。本研究同時還采用3個同源基因序列聯(lián)合測序分析對分離的MABC進行亞種鑒定，初步了解天津地區(qū)MBAC亞種分布，以期為臨床精準(zhǔn)診療MABC感染提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集天津市海河醫(yī)院分枝桿菌菌株庫2016-2019年保存的170株NTM菌株。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)蘇培養(yǎng)NTM菌株

將NTM菌株凍存管從-80 ℃冰箱取出，恢復(fù)至室溫，取適量接種于羅氏固體培養(yǎng)管，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察菌落生長情況。

1.2.2 NTM微陣列芯片法檢測

按照北京博奧生物集團公司分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）說明書要求提取NTM菌株核酸，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進行檢測，檢測儀器為杭州博日科技有限公司TC-96PCR儀，擴增試劑購自北京索萊寶公司。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min；94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，45個循環(huán)；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸60 s，20個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。配制雜交混合物，采用北京博奧生物集團公司BioMixerⅡ芯片雜交儀雜交2 h，轉(zhuǎn)速為5 rpm；用LuxScan 10 K/B微陳列芯片掃描儀判讀結(jié)果。

1.2.3 NTM同源序列測序

提取NTM菌株核酸后進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物有限公司進行測序。參考文獻[14]設(shè)計同源序列PCR擴增引物（表1）。

表1 PCR引物序列

測序得到的序列經(jīng)BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對確定菌種類型。將同源序列聯(lián)合分析結(jié)果作為最終鑒定結(jié)果，比較3個同源序列單獨分析和聯(lián)合分析的正確率；以同源序列聯(lián)合分析結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較微陣列芯片法菌種鑒定的正確率。

1.2.4 微陣列芯片法與同源序列測序菌種鑒定法樣本周轉(zhuǎn)時間（turn-around time，TAT）比較

比較微陣列芯片法和多同源序列測序法自醫(yī)生申請檢驗項目到收到檢驗報告的時間。

2 結(jié)果

2.1 微陣列芯片法和同源序列測序菌種鑒定結(jié)果

微陣列芯片法共鑒定出8個NTM菌種，同源序列測序共鑒定出14個菌種。微陣列芯片法無法鑒定緩慢生長群的猿分枝桿菌、慢生黃分枝桿菌、副瘰疬分枝桿菌和快速生長群的龜分枝桿菌、馬德里分枝桿菌、母牛分枝桿菌，多同源序列（16SrRNA、rpoB和hsp65）測序可鑒定出全部的菌種。以多同源序列測序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，微陣列芯片法鑒定到復(fù)合群的正確率為90.0%，16SrRNA、rpoB、hsp65單獨和3個同源序列測序聯(lián)合分析鑒定到復(fù)合群的正確率分別為93.5%、98.8%、99.4%和100.0%。見表2。

2.2 微陣列芯片法與多同源序列測序鑒定結(jié)果不一致菌種

以多同源序列測序結(jié)果作為參考，170株NTM菌株中，微陣列芯片法有153株鑒定結(jié)果與多同源序列測序結(jié)果一致，鑒定正確率為90.0%（153/170）。有17株未鑒定出或鑒定錯誤，見表3。

表3 微陣列芯片法與多同源序列測序鑒定結(jié)果不一致菌種

2.3 多同源序列測序龜/MABC亞種鑒定結(jié)果

將微陣列芯片法和16SrRNA測序鑒定為龜/MABC的53株菌株，采用同源序列（rpoB和hsp65）測序進行分析，結(jié)果顯示，有53株NTMrpoB和hsp65鑒定結(jié)果一致，最終鑒定出龜分枝桿菌6株、MABC膿腫亞種25株、MABC馬賽亞種20株、MABC bolletii亞種2株。

2.4 微陣列芯片法和多同源序列測序所需時間

微陣列芯片法鑒定單個樣本的TAT至少需要8 h，170株NTM菌株全部鑒定需要2 d。多同源序列測序鑒定單個樣本的TAT約需3 d，170株NTM菌株全部鑒定約需要5 d。

3 討論

不同NTM菌種對抗菌藥物的敏感性存在較大差異，且NTM感染患者全身中毒癥狀和臨床表現(xiàn)與結(jié)核病相似，極易被誤診。不同NTM菌種感染和受累組織不同，所致NTM病臨床表現(xiàn)各異，對于初次分離培養(yǎng)出的NTM菌株，在菌種未知的情況下，很難評估其臨床價值[1，15]。準(zhǔn)確、快速的NTM菌種鑒定對臨床診斷、鑒別診斷NTM病與結(jié)核病至關(guān)重要。微陣列芯片法菌種鑒定基于分枝桿菌屬16SrRNA編碼基因高變區(qū)差異，設(shè)計針對17種分枝桿菌的特異性探針，通過提取菌株核酸、PCR擴增和探針雜交、激光共聚焦掃描確定菌種類型。17種分枝桿菌包括了常見的16種NTM菌種，但對于臨床上較少見的NTM菌種則無法鑒定出。本研究170株NTM菌株中，有17株采用微陣列芯片法未鑒定出或鑒定錯誤，其中6株龜分枝桿菌、1株猿分枝桿菌、1株馬德里分枝桿菌、1株副瘰疬分枝桿菌和1株慢生黃分枝桿菌因不在鑒定范圍，故未鑒定出；2株胞內(nèi)分枝桿菌被鑒定為鳥分枝桿菌，是由于2種分枝桿菌的16SrRNA高變區(qū)序列高度相近，設(shè)計的探針錯誤結(jié)合導(dǎo)致的。有研究發(fā)現(xiàn)，盡管鳥分枝桿菌與胞內(nèi)分枝桿菌的區(qū)分具有流行病學(xué)意義，但未發(fā)現(xiàn)有重要的臨床價值[15]。

同源序列測序分析是常用的細菌菌種鑒定方法，16SrRNA基因測序可用于大多數(shù)分枝桿菌菌種鑒定，對于部分采用16SrRNA基因測序無法鑒定或鑒定失敗的NTM菌種，可考慮采用其他同源基因，如rpoB、hsp65，進行鑒定[16]。本研究4株較少見的分枝桿菌包括慢生黃分枝桿菌、副瘰疬分枝桿菌、猿分枝桿菌和馬德里分枝桿菌，因不在微陣列芯片法檢測范圍，采用16SrRNA基因測序和rpoB、hsp65基因測序，均被準(zhǔn)確鑒定出。另外，5株戈登分枝桿菌微陣列芯片法可鑒定出，但本研究所采用的16SrRNA基因測序引物卻擴增、鑒定失敗，考慮為設(shè)計的引物特異性問題，加做rpoB、hsp65基因測序后，均能被準(zhǔn)確鑒定。本研究中，rpoB基因測序僅鑒定出2株恥垢分枝桿菌中的1株，有1株母牛分枝桿菌鑒定失敗，其余168株NTM均能準(zhǔn)確鑒定；hsp65基因測序?qū)?株母牛分枝桿菌鑒定失敗，可準(zhǔn)確鑒定出其余169株NTM菌株。提示hsp65、rpoB基因測序用于分枝桿菌菌種鑒定優(yōu)于16SrRNA。KIM等[16]采用16SrRNA、hsp65和rpoB測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對的方法，對109株NTM臨床分離株進行菌種鑒定，發(fā)現(xiàn)單獨使用3個基因序列可鑒定出的菌種分別占71.3%、86.8%和81.6%，而聯(lián)合3個基因序列進行鑒定可將鑒定率提升至97.3%，證實了hsp65、rpoB對于NTM菌種的鑒別能力高于16SrRNA，多同源序列測序可明顯提高NTM菌種的鑒定效能。

龜分枝桿菌與MABC的16SrRNA基因序列高度一致，無法單獨采用16SrRNA測序進行鑒別[17]。本研究6株龜分枝桿菌中，采用微陣列芯片法和16SrRNA基因測序均無法與MABC進行區(qū)分，而采用16SrRNA聯(lián)合rpoB、hsp65，不僅能鑒別龜分枝桿菌與MABC，還可對MABC的3個亞種進行區(qū)分；53株微陣列芯片法無法區(qū)分的龜/MABC經(jīng)多同源序列測序分析后，鑒定出龜分枝桿菌6株、MABC膿腫亞種25株、MABC馬賽亞種20株、MABCbolletii亞種2株。MABC中，膿腫亞種、馬賽亞種、bolletii亞種所占比例分別為53.2%、42.6%、4.2%。目前尚未見有文獻報道天津市MABC各亞種的分布情況，本研究結(jié)果填補了相關(guān)數(shù)據(jù)的空白。關(guān)于MABC各亞種的分布，不同國家、地區(qū)所報道的結(jié)果不一致。有文獻報道膿腫亞種占71%～43%，馬賽亞種占21%～56%，bolletii亞種占1%～18%[18]。由于MABC的3個亞種對以克拉霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的治療反應(yīng)差異極大，膿腫亞種和bolletii亞種的erm（41）基因的T28型與克拉霉素誘導(dǎo)性耐藥相關(guān)，而馬賽亞種則不存在erm（41）基因相關(guān)的誘導(dǎo)性耐藥[7]。因此，了解不同地區(qū)MABC亞種的分布，對于MABC感染的預(yù)防和治療具有非常積極的作用。

微陣列芯片法在我國應(yīng)用于分枝桿菌菌種鑒定已多年，16SrRNA測序是目前細菌菌種鑒定最常用的測序方法。然而，微陣列芯片法是針對16SrRNA多變區(qū)設(shè)計探針，可鑒定的分枝桿菌僅有17種，無法有效區(qū)分與分枝桿菌和MABC及其亞種等序列高度相近的菌種，此時聯(lián)合使用16SrRNA、rpoB和hsp65測序，則可鑒定出絕大多數(shù)臨床常見和少見的NTM菌種。在臨床應(yīng)用時，需要綜合考慮微陣列芯片法和同源序列測序在TAT和準(zhǔn)確性方面的差異。本研究結(jié)果顯示，微陣列芯片法TAT約為8 h；同源序列測序TAT約為3 d，且目前一般臨床實驗室無法開展，需要外送。對于不同NTM菌種感染者，在選擇2種方法時應(yīng)基于臨床、患者需求和實驗室實際情況，微陣列芯片法無法區(qū)分的龜/MABC，采用同源序列測序準(zhǔn)確鑒定對于臨床用藥方案的選擇和調(diào)整至關(guān)重要。對于微陣列芯片法不能鑒定出的臨床少見分枝桿菌，如本研究中同源序列測序鑒定出的副瘰疬分枝桿菌、母牛分枝桿菌、慢生黃分枝桿菌，建議及時采用同源序列測序進行補充性鑒定，以便臨床明確診斷后及時參照診療指南選擇、確定用藥方案。

綜上所述，NTM菌種、型別的鑒定在臨床診療中極為重要。微陣列芯片法與多同源序列測序在NTM菌種鑒定方面各有優(yōu)缺點，微陣列芯片法鑒定準(zhǔn)確率基本能滿足臨床需求，TAT較短，但鑒定菌種范圍有限；多同源序列測序TAT相對較長，但可鑒定出絕大多數(shù)NTM菌種及其亞種，是微陣列芯片法和其他一些菌種鑒定方法的有效補充，可為臨床精準(zhǔn)治療提供實驗室依據(jù)。