姜黃素通過NLRP3炎性體信號通路在肺泡巨噬細胞焦亡模型中的作用機制

吳啟文,姚葉萍

(廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院感染科,廣東 廣州 511300)

急性肺損傷是由感染、創(chuàng)傷等多種原因引起的肺部急性嚴重疾病,其中感染是主要因素[1]。目前有研究發(fā)現(xiàn)細胞焦亡參與急性肺損傷過程,其可能機制是由NLRP3炎性體信號通路介導[2]。感染誘導的ALI目前抗生素是主要治療方法,但是由于抗生素的不合理應用,細菌耐藥率不斷升高,甚至出現(xiàn)超級細菌,引起了高度重視。因此中醫(yī)藥在治療ALI方面的彰顯治療價值。研究證實姜黃素在預防及治療肺損傷中具有一定的保護作用,可減輕LPS誘導的急性肺損傷小鼠炎性反應,其關鍵分子靶點可能與 THF-β1/SMAD、Akt/Erk、MAPK/NF-κB、Notch2/Hes-1、TLR4/MyD88/NF-κB等多條信號通路相關[3-5]。目前關于姜黃素在感染性ALI中調控細胞焦亡機制尚未見相關報道。因此,本研究將在LPS/尼日利亞菌素誘導ALI細胞模型中研究姜黃素通過阻斷NLRP3炎性體信號通路抑制細胞焦亡改善ALI的作用及機制,旨在為發(fā)現(xiàn)姜黃素治療ALI的可能性及機制提供試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1細胞:大鼠巨噬細胞系NR8383,購自中科院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑:姜黃素購自上海麥克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS)購自Biosharp公司;F12K培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技有限公司);雙抗(鏈霉素+青霉素)購自思拓凡生物科技有限公司;尼日利亞菌素購自麥克林公司;BCA法蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司;CCK-8購自日本同仁化工;NLRP3抗體(Anti-NLRP3 antibody)、 Caspase-1+p10+p12抗體(Anti-pro Caspase-1+p10+p12 antibody)、GSDMD抗體(Anti-GSDMD antibody)均購自美國Abcam公司;磷酸酶抑制劑購自南京凱基生物發(fā)展有限公司,本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1細胞分組及模型建立:大鼠巨噬細胞系NR8383在含有10%胎牛血清、80%F12K培養(yǎng)基中培養(yǎng),消化傳代后接種12 h后進行分組,分為空白對照組、姜黃素組、LPS 組、LPS+姜黃素組、LPS+尼日利亞菌素處理組、LPS+尼日利亞菌素+姜黃素處理組,并對細胞進行加藥處理,給藥方法如下:①空白對照組:使用預先加入10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基正常培養(yǎng),不使用任何藥物刺激;②姜黃素組:使用預先加入10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基正常培養(yǎng),加入10 μmol/L姜黃素進行刺激,2 h后進行檢測。③LPS 組:更換無血清培養(yǎng)基12 h后,細胞培養(yǎng)基中加入LPS溶液(終濃度為100 ng/ml),2 h后進行檢測。④LPS+姜黃素組:更換無血清培養(yǎng)基12 h后,細胞培養(yǎng)基中加入姜黃素(終濃度為10 μmol/L)和LPS溶液(終濃度為100 ng/ml)進行刺激,2 h后進行檢測。⑤LPS+尼日利亞菌素處理組:更換無血清培養(yǎng)基12 h后,細胞培養(yǎng)基中加入LPS溶液(終濃度為100 ng/ml),4 h后實驗孔加入尼日利亞菌素溶液(終濃度為10 μmol/ml),2 h后收細胞進行檢測。⑥LPS+尼日利亞菌素+姜黃素處理組(3個重復):更換無血清培養(yǎng)基12 h后,細胞培養(yǎng)基中加入姜黃素(終濃度10 μmol/L)和LPS溶液(終濃度為100 ng/ml),4 h后實驗孔加入尼日利亞菌素溶液(終濃度為10 μmol/ml),2 h后收細胞進行檢測。

1.2.2CCK8法測定各組細胞的活力:大鼠巨噬細胞系NR8383細胞,正常復蘇后,用含10%胎牛血清、80%F12K培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng),每2～3天傳代1次。將對數(shù)生長期細胞NR8383離心處理,800 r/min,10 min,離心后對細胞進行計數(shù),之后接種于96孔板中,每孔接種2×104個細胞,每孔加100 μl的細胞培養(yǎng)液。接種12 h后進行分組,并對細胞進行加藥處理,6個孔/組。各組分別加入相應的藥物或試劑后,置培養(yǎng)板于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h。2 h后加入CCK-8進行反應,3 h檢測各組細胞的OD值。

1.2.3Western印跡法檢測細胞中蛋白表達水平:大鼠巨噬細胞系NR8383細胞接種在196孔培養(yǎng)板內(nèi),各組給藥2 h后棄去培養(yǎng)基,加入裂解液提取細胞內(nèi)的蛋白,根據(jù)蛋白濃度的檢測結果將含有20 μl蛋白的樣本用于蛋白質印跡檢測,依次進行SDS-PAGE電泳、電轉PVDF膜、5% 脫脂牛奶封閉、特異性一抗孵育、辣根過氧化物酶二抗孵育,最后在顯影系統(tǒng)內(nèi)采用電化學發(fā)光法曝光得到目的 蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD 及內(nèi)參蛋白的條帶,根據(jù)條帶的灰度值計算蛋白表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法:所有數(shù)據(jù)應用SPSS21.0軟件進行χ2及t檢驗;計量資料數(shù)據(jù)方差齊,或數(shù)據(jù)經(jīng)轉換后方差齊,則采用組間兩兩比較的單因素方差分析方法;若數(shù)據(jù)經(jīng)轉換后方差仍不齊,采用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。百分率的比較采用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1姜黃素對LPS和尼日利亞菌誘導焦亡細胞增殖率的影響:胞培養(yǎng)在有血清的情況下,與空白組(0.977±0.088)相比,姜黃素(1.111±0.106)提高細胞活力,促進細胞增殖。細胞培養(yǎng)在無血清的情況下,與LPS組(0.746±0.026)相比,LPS+姜黃素組(0.674±0.036)降低細胞活力,抑制細胞增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);同時在無血清的情況下,與LPS+尼日利亞菌素組(0.138±0.003)相比,LPS+姜黃素+尼日利亞菌素組(0.144±0.006)提高細胞活力,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),促進細胞增殖。

2.2Western印跡檢測姜黃素對LPS和尼日利亞菌誘導焦亡細胞NLRP3、GSDMD蛋白表達情況:與空白對照組比較,姜黃素組細胞的Caspase-1略微降低,NLRP3和GSDMD均呈現(xiàn)升高的趨勢。與LPS組比較,姜黃素+LPS組細胞的NLRP3、Caspase-1兩個凋亡蛋白均上升,GSDMD凋亡蛋白均下降。與LPS+尼日利亞菌素組比較,LPS+尼日利亞菌素+姜黃素組細胞的NLRP3、Caspase-1、GSDMD三個凋亡蛋白均一致下降,而且下降幅度較大,提示在這個模型的條件下,姜黃素有抑制細胞凋亡的作用。見圖1。

圖2 Western印跡法檢測NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白在細胞中的表達

3 討論

ALI是常見的臨床危及重癥,關于ALI的發(fā)病機制以及治療ALI是目前醫(yī)學領域的研究熱點。感染是ALI常見的發(fā)生因素,其中內(nèi)毒素脂多糖是重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn),細胞焦亡與機體在病原體感染時的炎性反應有密切的關系。細胞焦亡是經(jīng)由Gasdermin家族蛋白介導的質膜膜孔形成的可調控性細胞死亡,經(jīng)常但并不總因炎性反應性Caspase的活化而完成[6]。肺泡巨噬細胞約占肺內(nèi)白細胞總數(shù)的 95%,巨噬細胞焦亡可以上調炎性反應水平,進一步加重免疫反應失控,參與ALI的發(fā)展進程[7]。

姜黃素是姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種脂溶性酚類物質。近年來多項研究顯示:姜黃素能夠通過調節(jié)多個信號通路的關鍵分子靶點,發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡、抗病毒、抗癌和免疫調節(jié)等活性,從而保護臟器功能[8-11]。

細胞焦亡是機體重要的免疫反應,能快速清除各種病原微生物,限制病菌生長,在拮抗感染和內(nèi)源性危險信號中發(fā)揮重要作用[12-14]。Rühl S及Kayagaki N等學者研究發(fā)現(xiàn),焦亡能發(fā)生在括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌等感染宿主細胞的細菌上,同時破壞細菌和宿主細胞,周圍未被感染的健康細胞則無任何損傷[15-16]。本研究提示姜黃素可能抑制感染細胞增殖的能力,從而加速機體清除病原。

2018年Kambara等[17]發(fā)現(xiàn)不依賴Caspase酶切割 GSDMD引發(fā)中性粒細胞焦亡現(xiàn)象,揭示細胞焦亡發(fā)生由其識別水解的底物 Gasdermin家族蛋白決定,不由Caspase 酶決定。本研究提示LPS誘導巨噬細胞焦亡損傷模型中,姜黃素可以通過非NLRP3-Caspase-1途徑通過下調GSDND蛋白,從而抑制細胞焦亡,具體機制尚待進一步實驗驗證。

GSDMD蛋白介導細胞焦亡過度發(fā)生的伴隨大量的包括IL- 1β、IL-18等炎性細胞因子的釋放,因此過度的焦亡可能誘導大量炎性細胞的浸潤,導致強烈的炎性反應,機體可能出現(xiàn)敗血癥等嚴重不良反應[18-19]。本研究結果提示在這個細胞焦亡劇烈的條件下,姜黃素有通過NLRP3炎性體信號通路抑制細胞焦亡的作用。

本研究通過實驗證實姜黃素能夠顯著減輕 LPS/尼日利亞菌素所致致肺泡巨噬細胞的焦亡反應,其機制可能與其抑制抑制NLRP3炎性體信號通路有關。本研究存在不足之處,未同時進行IL- 1β、IL-18炎性因子的檢測。目前細胞焦亡的分子機制仍在進一步探索中,姜黃素在生物體內(nèi)的安全性如何,作用的具體的分子機制如何,均需更多的研究深入探討。