日周期光熱干露脅迫對泰來草生理特性的影響

李照陽, 史云峰, 蔡嘉麗, 趙牧秋, 史志強, 羅慧玨, 韓秋影

( 1. 海南熱帶海洋學院 崖州灣創(chuàng)新研究院, 海南 三亞 572022; 2. 海南省現代化海洋牧場工程研究中心, 海南 三亞 572022; 3. 海南省近岸海洋生態(tài)環(huán)境過程與碳匯重點實驗室, 海南 三亞 572022 )

海草是世界范圍內淺水潟湖、海岸及河口區(qū)的關鍵物種,以其為主要生物類群構建的海草床是海岸帶重要的生態(tài)系統(tǒng)類型(蔡澤富等,2021)。海草床可為眾多的海洋生物提供食物來源、棲息地和產卵場(Unsworth &Cullen, 2010),兼具產氧、調節(jié)營養(yǎng)、固碳、穩(wěn)定沉積物和減少病原體(Duarte &Krause, 2017)等生態(tài)功能。據估算,全球海草床的生態(tài)服務價值不低于1.9萬億美元,對商業(yè)漁業(yè)的支持價值高達3 500美元·hm-2·a-1(Waycott et al., 2009)。然而,全球氣候變化和人類活動導致的多種脅迫正在威脅海草床的健康,自1990年以來,海草分布面積以每年7%的速度下降,全球多達35%的海草床退化明顯(Manassa et al., 2017)。

干露是指水生生物因離開水體而停留在非水介質中的狀態(tài),生物在干露條件下維持生命活動的時長稱為露空時間(姜令緒等,2012)。受潮汐作用影響,主要分布于潮間帶的海草床淹水和干露狀態(tài)交替進行(Kim et al., 2016),如果干露發(fā)生于晝間,就會伴隨高溫、強光等多重脅迫的疊加作用。因此,潮汐引起的日周期性干露成為制約海草在潮間帶分布的重要因素(Shafer et al., 2007)。董益等(2021)研究表明隨著海草露空時間的延長,其葉片表面水分會大量蒸發(fā),細胞內電解質濃度逐漸升高,致使細胞質膜結構變化,細胞內生物化學反應抗性增加。劉洪亮等(2014)研究表明長期干露會導致可用于海草光合作用的CO2濃度降低,光合與呼吸作用失衡,光系統(tǒng)Ⅰ與Ⅱ之間的電子傳遞被阻隔,最終造成海草葉片出現不可修復的損傷。Stapel等(1997)研究表明潮汐干露疊加強光和高溫可能導致海草在短期內大量死亡,植株密度和覆蓋率驟降。

泰來草(Thalassiahemprichii)是熱帶西太平洋和印度洋海草群落的優(yōu)勢種,以及海南島東、南部海草床的主要建群種,通常會占據海岸帶的高潮間帶至中潮間帶區(qū)域(陳石泉等,2020)。泰來草的分布面積和生物量通常會表現出顯著的季節(jié)性差異,這可歸因于光照、溫度、水文條件、營養(yǎng)鹽含量等環(huán)境因素的周期性波動(蔡澤富等,2017);潮汐干露可能是引起泰來草床結構和功能季節(jié)性差異的重要原因(Azevedo et al., 2016)。比如,在海南陵水的新村潟湖,分布在高潮間帶的泰來草每次大潮過程的露空時間為2～3 h·d-1(Jiang et al., 2014),足以引起海草發(fā)生不可逆損傷。

盡管已有研究對泰來草一次性短期干露過程脫水率與光合活性的關系進行了探索(Jiang et al., 2014; Wuthirak et al., 2016),但針對周期性潮汐干露與強光和高溫相疊加對其生長和生理特性影響的研究尚較缺乏。鑒于此,本研究以熱帶優(yōu)勢海草泰來草為對象,通過在日光溫室內模擬高溫和強光環(huán)境,探索日周期光熱干露脅迫對泰來草生長和生理特征的影響,擬探討:(1)日周期光熱干露脅迫對泰來草的生長速率、光合生理、抗氧化活性及代謝物質含量的影響;(2)隨露空時間的延長,日周期光熱干露脅迫對泰來草生長和生理特性影響程度的變化;(3)泰來草承受日周期光熱干露脅迫的極限時長。以期為深入了解泰來草在潮間帶生境中的生長適應機制和季節(jié)分布規(guī)律,以及為受損泰來草床生態(tài)修復時的位置選擇和管護技術開發(fā)提供理論依據和支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用泰來草于2021年7月低潮(潮高小于50 cm)時采自海南省三亞市小東海海區(qū)(109°29′48″ E、18°12′33″ N)。采樣時泰來草莖枝密度為(1 354±123) ind·m-2、株高(10.5±1.2) cm、葉寬(0.75±0.04) cm。采集海草時連同10 cm厚沉積物一并取出。將采集的原狀泰來草及沉積物置于水族箱(37 cm × 25 cm × 22 cm)中,去除死亡和衰老葉片以及健康葉片上的附生生物,添加海水至沒過海草葉片,運回實驗室并置于日光溫室內暫養(yǎng)(2周)備用。期間使用小型造浪泵保持海水呈流動狀態(tài),每2 d更換一次海水。

1.2 試驗設計

根據前期調查和預試驗結果,結合Jiang等(2014)和Wuthirak等(2016)的研究,下列結論用于指導本研究的設計:海南三亞周邊海域潮汐類型為不規(guī)則日潮,泰來草光熱潮汐干露主要出現在14:00—17:00;泰來草連續(xù)日周期性干露時間一般不超過7 d,平均露空時間通常不超過2 h·d-1,光熱條件下連續(xù)露空時間超過60 min可能引起不可逆損傷;泰來草干露復水12～24 h后,其最大光合效率(Fv/Fm)可趨于穩(wěn)定。

共設置6個處理:CK(不進行露空處理)、PTD10(露空時間10 min·d-1)、PTD20(露空時間20 min·d-1)、PTD40(露空時間40 min·d-1)、PTD60(露空時間60 min·d-1)和PTD90(露空時間90 min·d-1)。試驗在日光溫室內開展,每處理重復3次。試驗期間每天14:00將進行光熱干露處理水族箱內的海水抽干,使泰來草葉片完全暴露于空氣中。干露達到試驗預設的露空時間后,立即對海草進行復水至沒過所有海草葉片。光熱干露處理連續(xù)進行7 d,最后一次干露復水24 h后開始對泰來草的各項生理和生化指標進行測定。

試驗所用海水取自海南三亞附近海域。試驗中使用小型造浪泵保持水族箱內海水緩慢流動,其間海水鹽度為(31±2)‰,pH為8.08±0.04,溶解氧為(6.44±0.68) mg·L-1,NO3--N為(0.043±0.012) mg·L-1,NH4+-N為(0.026±0.009) mg·L-1,PO43--P為(0.012±0.003) mg·L-1。試驗期間應用光溫測量儀(HOBO-UA-64,美國)監(jiān)測,并記錄溫室內的溫度和光量子通量密度,頻率為60 min·次-1。

1.3 生長速率、光合色素含量和葉綠素熒光參數測定

試驗期間泰來草的生長速率采用針孔法測定(Zieman,1974)。選取泰來草成熟葉片,采用改進的80%丙酮浸提比色法(舒展等,2010),分別測定其葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量,結果以每g鮮重的海草葉片所含有的光合色素mg數表示。

采用水下調制葉綠素熒光儀(DIVING-PAM-II,德國)測定泰來草葉片葉綠素熒光參數。每箱隨機選取1株海草,對其第二幼葉中部進行測定。測定誘導曲線前將海草植株置于黑暗條件下暗適應20 min,開啟測定程序后,由WinControl 3.0(Walz,德國)軟件自動記錄暗適應下的最小熒光(Fo)和最大熒光(Fm),參照Fang等(2020)的公式計算光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的最大光合效率(Fv/Fm)、光化學淬滅系數(qP)、實際光化學量子效率(ΦPSⅡ)和表觀光合電子傳遞速率(electron transport rate, ETR)。

1.4 抗氧化酶活性、非結構碳水化合物含量和次生代謝物質含量測定

每箱隨機選取3～5株泰來草,將其分割為葉片和根兩部分,并分別將所有葉片和根混合。取一部分新鮮葉片或根,分別測定其抗氧化酶[過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性和丙二醛(MDA)含量;取另一部分置于60 ℃持續(xù)烘干48 h至恒重,粉碎后用于測定非結構碳水化合物(淀粉、可溶性糖)和次生代謝物質(總酚、總黃酮)含量。

泰來草葉片和根的POD、SOD、CAT酶活性及MDA含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定,具體操作參照試劑盒說明書進行;非結構碳水化合物(淀粉、可溶性糖)含量測定參照Jiang等(2013)的方法;次生代謝物質(總酚、總黃酮)含量測定參照孫倩等(2019)的方法。

1.5 數據統(tǒng)計分析

每一時刻的溫度和光量子通量密度采用7 d所采集數據的平均值表示。各光熱干露處理數據以平均值±標準差表示;采用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26.0進行數據統(tǒng)計分析和繪圖。對數據進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,如果不符合,則進行數據轉換;不同處理之間的差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA,P<0.05),采用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 溫度和光量子通量密度

本研究開展時正值海南省夏季(7—8月)。試驗期間天氣晴朗,日光溫室內的平均溫度和光量子通量密度如圖1所示,溫度波動為27.5 ℃(6:00)～44.5 ℃(14:00),光量子通量密度為0～1 967 μmol·m-2·s-1(12:00)。每天14:00開始處理光熱干露,此時日光溫室內平均溫度為44.5 ℃,平均光量子通量密度為1 682 μmol·m-2·s-1;各處理露空時間最長為90 min(PTD90),該處理每天光熱干露結束時(15:30)溫度接近41.0 ℃,光量子通量密度約為633 μmol·m-2·s-1。

○表示光熱干露開始時日光溫室內的平均溫度和光量子通量密度?！?indicates the average temperature and photon flux density in the greenhouse at the beginning of photothermal desiccation experiment.圖 1 試驗期間日光溫室內的平均溫度和光量子通量密度Fig. 1 Average temperature and photon flux density in greenhouse during experiment

圖 2 試驗結束時不同光熱干露處理泰來草的葉片狀態(tài)Fig. 2 Leaf states of different photothermal desiccation treatments at the end of experiment

不同字母表示處理間差異顯著 (P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences between treatments (P<0.05). The same below.圖 3 不同光熱干露處理泰來草的葉片生長速率Fig. 3 Leaf growth rates of Thalassia hemprichii for different photothermal desiccation treatments

2.2 泰來草葉片狀態(tài)和生長速率

試驗結束時,不同光熱干露處理泰來草葉片展示出不同的狀態(tài)(圖2)。連續(xù)7 d每天10 min的光熱干露處理(PTD10),泰來草葉片與CK比較未發(fā)生明顯變化。當露空時間達到20 min·d-1(PTD20)時,葉片上緣開始出現少許褐色損傷斑,但并不嚴重;露空40 min·d-1(PTD40)時,有近1/3的葉片轉為黃褐色;當露空≥60 min·d-1(PTD60和PTD90)時,整個海草葉片均呈褐色,并且PTD90處理葉片已從上緣開始干枯?？梢?隨露空時間的延長,日周期光熱干露對泰來草葉片的損傷程度隨之加重。

如圖3所示,CK處理泰來草葉片生長速率為(0.88±0.03) mm·d-1;與CK相比,PTD10和PTD20處理葉片生長速率未呈現顯著性差異(P>0.05)。當露空時間≥40 min·d-1時,海草葉片生長速率顯著低于CK(P<0.05),PTD40、PTD60和PTD90處理葉片生長速率分別為CK的65%、45%和15%。由此可見,較短的露空時間(≤20 min·d-1)對泰來草葉片生長速率無影響,而長時間的光熱干露(≥40 min·d-1)會顯著抑制泰來草葉片的生長(P<0.05),并隨露空時間延長抑制效應增強。

2.3 泰來草葉片光合色素含量和葉綠素熒光參數

如圖4所示,隨露空時間的延長,泰來草葉片光合色素(葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素)含量及葉綠素a/葉綠素b均呈降低趨勢。與CK相比,PTD10處理的光合色素含量及葉綠素a/葉綠素b均無顯著性差異(P>0.05)。當露空時間≥20 min·d-1時,光合色素含量與CK比較顯著降低(P<0.05),但葉綠素a的降低程度明顯高于葉綠素b,導致不同處理的葉綠素a/葉綠素b隨露空時間的延長而降低。

由表1可知,不同光熱干露處理泰來草葉片Fo無顯著性差異(P>0.05),其他葉綠素熒光參數(Fm、Fv/Fm、qP、ΦPS Ⅱ和ETR)均隨露空時間延長而降低。PTD10處理的所有葉綠素熒光參數與CK比較均未呈現顯著性差異(P>0.05);露空時間≥20 min·d-1處理的Fm和Fv/Fm顯著低于CK(P<0.05);露空時間≥40 min·d-1處理的ΦPSⅡ和ETR顯著低于CK(P<0.05);僅有PTD90處理的qP顯著低于CK(P<0.05)。

2.4 泰來草葉片和根抗氧化酶活性和MDA含量

如圖5所示,葉片和根的POD、SOD和CAT酶活性及MDA含量總體上隨露空時間的延長而升高。除根的POD外,PTD10處理海草葉片和根的抗氧化酶活性和MDA含量與CK比較均無顯著性差異(P>0.05)。隨露空時間的延長,葉和根的POD、CAT酶活性以及葉的MDA含量增加迅速;而葉和根的SOD酶活性以及根的MDA含量在露空時間≥20 min·d-1時幾乎不再發(fā)生顯著性變化(P>0.05)。

2.5 泰來草葉片和根非結構碳水化合物和次生代謝物質含量

如圖6所示,隨露空時間的延長,葉片和根的可溶性糖含量呈升高趨勢,根的淀粉含量呈下降趨勢,葉片的淀粉、總酚和總黃酮含量呈先升高后降低趨勢,而根的總酚和總黃酮含量在各處理間未呈現顯著性差異(P>0.05)。與CK比較,PTD10處理泰來草僅葉片的總酚含量顯著升高(P<0.05),其他指標均未出現顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

海水的潮汐運動,使海草等生長在潮間帶的植物通常經歷周期性干露。在缺水、高鹽和熱應激等綜合作用下,干露過程可能會對海草的生理、生長和繁殖產生影響,進而影響其在潮間帶的分布狀況(Clavier et al., 2011)。干露過程的持續(xù)時間是影響海草生長和生物量積累的主要因素之一(Collier & Waycott, 2014)。Unsworth等(2012)研究發(fā)現,海菖蒲草床地上部生物量和生長速率下降明顯,并與潮汐干露存在顯著相關性。Suykerbuyk等(2018)研究證實,隨干露時間的延長,諾氏鰻草(Zosteranoltii)的生長速率降低,導致地上生物量減少。本研究結果表明,日周期光熱干露脅迫對泰來草的生長存在負面影響。在溫度超過40 ℃、光量子通量密度超過800 μmol·m-2·s-1的夏季午后,露空40 min·d-1泰來草的生長速率降低了35%,而當露空時間達到90 min·d-1時,海草的生長速率則為CK的15%。本研究是在充分調查三亞周邊海域泰來草的潮汐干露狀況后設計的,即該海區(qū)夏季泰來草的潮汐干露主要出現在午后,其露空時間最長達2 h·d-1。盡管干露發(fā)生時的實際溫度可能稍低于本研究所采用的日光溫室,但自然條件可能具有更高的光量子通量密度和更快的水分蒸發(fā)損失?？梢酝茰y,在夏季午后的光熱干露過程中,三亞海區(qū)潮間帶泰來草的生長速率可能受到極大抑制,進而影響其生物量和分布狀況。

本研究結果顯示,隨泰來草露空時間的延長,葉片顏色由綠色逐漸變?yōu)楹稚?說明海草葉片細胞內的葉綠體已遭受嚴重破壞(董益等,2021)。光合色素含量測定結果表明,當露空時間超過20 min·d-1時,泰來草葉片的葉綠素含量顯著低于對照。隨著露空時間的延長, 泰來草的生長速率和葉綠素熒光參數降低,抗氧化酶活性和MDA含量升高。這充分說明海草體內活性氧的產生與清除平衡狀態(tài)被打破,累積的活性氧導致海草葉片細胞損傷和葉綠素含量的降低(Seddon &Cheshire, 2001)。林植芳等(1984)認為光合色素中葉綠素a對環(huán)境變化脅迫的反應比葉綠素b更敏感,脅迫發(fā)生時大量積聚的活性氧可能特異性地破壞葉綠素a,而對葉綠素b的破壞作用較低,最終可能導致葉綠素a/葉綠素b降低。本研究結果支持這一結論。因此,考慮通過泰來草葉綠素a/葉綠素b下降的程度來評價其受光熱干露脅迫的程度。

圖 4 不同光熱干露處理泰來草葉片的光合色素含量Fig. 4 Photosynthetic pigment contents of Thalassia hemprichii leaves for different photothermal desiccation treatments

不同小寫字母表示不同處理泰來草葉片間存在顯著性差異 (P<0.05); 不同大寫字母表示不同處理泰來草根間存在顯著性差異 (P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences between treatments for the leaves of Thalassia hemprichii (P<0.05); different uppercase letters indicate significant differences between treatments for the roots of T. hemprichii (P<0.05). The same below.圖 5 不同光熱干露處理泰來草的抗氧化酶活性和MDA含量Fig. 5 Antioxidant enzyme activities and MDA contents of Thalassia hemprichii for different photothermal desiccation treatments

圖 6 不同光熱干露處理泰來草的非結構碳水化合物和次生代謝物質含量Fig. 6 Nonstructural carbohydrate and secondary metabolite content of Thalassia hemprichii for different photothermal desiccation treatments

表 1 不同光熱干露處理泰來草葉片的葉綠素熒光參數Table 1 Chlorophyll fluorescence parameters of Thalassia hemprichii leaves for different photothermal desiccation treatments

本研究各光熱干露脅迫處理隨露空時間的延長,除Fo外的所有葉綠素熒光參數(Fm、Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR)均降低,這表明隨露空時間的延長,泰來草葉片的光能利用率、光合作用的能量轉換和PS Ⅱ活性等都隨露空時間的延長而降低。這是細胞脫水導致內部電解質濃度激增,損傷了植物葉片類囊體及葉綠素-蛋白質復合物的結構(Malea et al., 2019),進而影響葉綠素熒光參數(Wuthirak et al., 2016; Papathanasiou et al., 2020)。植物的最大光合效率(Fv/Fm)常被用于衡量各種環(huán)境脅迫下葉綠體PS Ⅱ活性的高低,通常逆境條件下該參數會明顯降低(張景平和黃小平,2009),Fv/Fm<0.44則意味著PS Ⅱ反應中心完全失去活性(Schansker &Rensen, 1999)。本研究露空時間最長的PTD90處理在試驗結束時泰來草葉片的Fv/Fm為0.45,表明其已接近完全失活,即在試驗設定條件下,連續(xù)7 d每天90 min的露空已是泰來草所能承受光熱干露脅迫的上限。

本研究中,無論是泰來草的葉片還是根,其MDA含量均隨露空時間的延長而升高,說明經光熱干露脅迫處理后的泰來草,其葉片細胞膜可能遭受了不同程度的傷害,并且傷害隨露空時間的延長而增強(于飛等,2014)。本研究結果表明,干露脅迫使泰來草葉片和根的POD、SOD、CAT酶表現出較高的活性且隨露空時間的延長而快速升高,這是其體內活性氧和自由基升高所誘導的結果(Brierley &Kingsford, 2009; Rakhmad et al., 2019)。干露脅迫發(fā)生時,盡管泰來草抗氧化酶活性顯著升高(P<0.05),但在逆境條件下植物體內生成的活性氧仍超過抗氧化酶體系的清除能力,使部分未能清除的活性氧引起膜脂過氧化,最終表現為MDA含量升高,葉片光合色素含量降低且由綠色變?yōu)楹稚?葉綠素熒光參數下降,生長速率受到抑制。本研究結果還表明,隨露空時間的延長,泰來草不同類型抗氧化酶活性變化趨勢表現不同,POD和CAT隨露空時間的延長急劇升高,而SOD在露空超過20 min·d-1后幾乎不再發(fā)生變化。導致這種現象的原因可能是植物體內不同類型過氧化物和自由基產量不均衡,使其誘導的不同類型抗氧化酶活性變化趨勢出現差異(魏愛麗和王志敏, 2004)。

本研究中,隨露空時間的延長,泰來草葉片淀粉含量呈先升高后降低趨勢,其原因可能是中等時長(20～40 min·d-1)的光熱干露影響了海草對氮營養(yǎng)的吸收,使葉片蛋白質合成受阻,進而導致碳水化合物含量的相對升高(Clabby &Osborne, 1997;孫倩等,2019)。與葉片不同,泰來草根的淀粉含量則隨露空時間的延長呈降低趨勢。一方面,隨露空時間的延長,泰來草光合效率降低,合成且轉移儲存至根部的淀粉量降低(江志堅等,2012);另一方面,海草抵御外部環(huán)境脅迫以及修復受損組織需要消耗更多物質和能量,可能導致根中儲存的淀粉作為碳源和能源被大量利用,使其含量降低。與淀粉不同,無論是葉片還是根中的可溶性糖含量均隨露空時間的延長而升高,其原因可能是植物細胞通過合成大量的可溶性糖作為滲透調節(jié)物質來降低細胞內水勢,維持較高滲透壓以抵制不良環(huán)境,從而保證細胞的正常生理功能(Koch et al., 2007; Touchette, 2007)。

泰來草葉片中的總酚和總黃酮含量均隨露空時間的延長呈先升高后降低趨勢。其原因可能是露空時間較短(≤20 min·d-1)時,光合作用受抑制尚不嚴重,植物體能夠按照脅迫作用的強弱誘導生成次生代謝物質(Trevathan-Tackett et al., 2015);干露脅迫較強(≥40 min·d-1)時,光合速率顯著降低,植物所生產的有限有機物質主要用于合成可溶性糖等滲透調節(jié)物質,次生代謝物質的合成因受組織內可利用碳、氮等物質的制約而無法大量合成。隨干露脅迫的增強,泰來草葉片內總酚和總黃酮含量與淀粉含量的變化趨勢基本一致,印證了植物體內含碳次生代謝物質與可利用碳水化合物含量呈正相關的觀點(Stamp, 2003)。

本研究結果表明,熱帶地區(qū)夏季午后的光熱干露時長可能是限制泰來草分布上限的重要因素,連續(xù)1周每天露空20 min以上可顯著損傷海草的生理機能,并可能對海草床生物量、生產力及分布密度等產生影響,進而限制其生態(tài)功能的發(fā)揮。在進行海草床的生態(tài)修復時,應充分考慮修復區(qū)所處潮位,避免潮位過低所引起的光照限制,以及潮位過高所導致的光熱干露脅迫。修復區(qū)位于較高潮位、海草在低潮周期光熱干露時間較長時,應適當采取遮光、降溫措施,確保海草免受不可逆損傷。

綜上所述,日周期光熱干露脅迫對泰來草的生理特性具有重要影響,露空時間的長短對干露脅迫效應起決定性作用。日光溫室條件下,連續(xù)7 d每天10 min的光熱干露脅迫對泰來草不產生顯著性影響(P>0.05)。露空時間20～90 min·d-1(連續(xù)7 d)時,隨干露脅迫時間的延長,泰來草葉片的損傷程度加重,光合色素含量、葉綠素熒光參數及生長速率均呈降低趨勢,葉片和根的MDA、可溶性糖含量及POD、SOD、CAT酶活性呈升高趨勢,葉片淀粉、總酚、總黃酮含量呈先升高后降低趨勢,根淀粉含量呈降低趨勢。90 min·d-1(連續(xù)7 d)的干露脅迫處理泰來草葉片葉綠體PS Ⅱ光合反應中心已接近完全失活,達到泰來草承受日周期光熱干露脅迫的極限。本研究結果為深入了解泰來草在潮間帶生境中的生長適應機制和季節(jié)分布規(guī)律,以及為受損泰來草床生態(tài)修復時的位置選擇和管護技術開發(fā)提供了依據。