樟子松固沙林地可培養(yǎng)溶磷細(xì)菌的篩選及鑒定

李建男，郝若堯，樊麗婷，李玉萌，張勝男，孟建宇

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院旱寒區(qū)環(huán)境微生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

磷是植物生長必需的第二營養(yǎng)元素， 對植物的生長發(fā)育有著重要作用， 磷可以加速植物的根系和幼芽的生長，促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)植物的呼吸作用和養(yǎng)分和水分的吸收；促進(jìn)植物脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物的代謝、合成、運(yùn)轉(zhuǎn)；提高植物的抗旱、抗寒、抗病和抗鹽堿的能力，并增強(qiáng)植物的抗逆性，改善產(chǎn)品的品質(zhì)；縮短根瘤的發(fā)育和存活時(shí)間，增加根瘤的體積、數(shù)量和氮素同化量，促進(jìn)豆科植物根系的生長，提高豆科植物產(chǎn)品的含氮量和產(chǎn)量。 磷元素往往以難溶性磷的形式存在，植物很難吸收利用，所以在低水平可利用磷素的樟子松林地， 可利用磷的缺失必定會嚴(yán)重影響其幼苗的生長[1]。

樟子松 （Pinus sylvestris） 是一種具有抗旱、耐寒、耐貧瘠、抗病蟲害等抗逆能力的針葉樹種[2]，在我國西北、華北、東北地區(qū)廣泛分布，在遏制土地荒漠化、保護(hù)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)牧生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。但是，近幾年樟子松固沙林出現(xiàn)了嚴(yán)重的退化[3]。 有研究表明， 樟子松固沙林土壤含磷量處于我國森林生態(tài)系統(tǒng)土壤磷素含量的最低水平[4]，生長在荒漠地區(qū)的樟子松生長本就受干旱脅迫影響， 再加上土壤中可利用的磷含量較低，嚴(yán)重影響了樟子松的生長。

大量研究表明， 土壤中存在大量的溶磷菌（Phosphate Solubilizing Bacteria，PSB）， 溶磷菌是指能夠?qū)⑼寥乐胁蝗苄粤邹D(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的磷的一類細(xì)菌。 目前發(fā)現(xiàn)具有溶磷作用的細(xì)菌有芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞桿菌（Pseudomonas）、歐文氏菌（Erwinia）、土壤桿菌（Agrobacterium）、沙雷氏菌（Serratia）、 黃桿菌 （Flavobacterium）、 腸桿菌（Enterbacter）、 微球菌 （Micrococcus）、 固氮菌（Azotobacter）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、沙門氏菌（Saimonella）、色桿菌（Clromobacterium）、產(chǎn)堿菌（Alcaligenes）、 節(jié)桿菌 （Arthrobacter）、 硫桿菌（Thiobacillus）、埃希氏菌（Escherichia）[5-6]等。 有研究發(fā)現(xiàn)，將溶磷菌接種于植物后能顯著增加土壤及植株的磷、鉀、鎂等礦質(zhì)元素含量[7-9]，而且溶磷菌還可以改善植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)，并對植物生理指標(biāo)有積極影響[10]。 邢芳芳等[11]分離得到的解磷菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對白菜具有明顯的促生作用，經(jīng)其處理后，白菜葉片數(shù)、葉綠素，以及產(chǎn)量都得到明顯提高，這說明本研究具有一定的可行性。

鑒于此， 本研究對遼寧省彰武縣樟子松固沙林的土壤樣品中的溶磷菌進(jìn)行分離鑒定、 測定溶磷能力、分析固沙林土壤中的溶磷菌類群，旨在為后續(xù)溶磷菌能否對植物尤其是生存環(huán)境較差的植物產(chǎn)生促生效果提供理論基礎(chǔ)， 在不破環(huán)生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)上使用微生物對植物的生長產(chǎn)生積極影響， 并且可以豐富功能根際促生細(xì)菌資源庫以及開發(fā)新的改善土壤磷素營養(yǎng)的途徑， 并為后續(xù)微生物肥料研發(fā)及樟子松固沙林修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 土壤樣品采自遼寧省彰武縣章古臺試驗(yàn)基地，利用多點(diǎn)采樣法，選取7 點(diǎn)去除土壤表面枯枝落葉，收集深度為0～20 cm 的土壤，裝入無菌采樣袋，混合均勻后，置于4 ℃車載冰箱中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溶磷細(xì)菌的分離和純化。

1.1.2 培養(yǎng)基配方[12]無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，硫酸銨0.5 g·L-1，氯化鈉0.3 g·L-1，氯化鉀0.3 g·L-1，七水硫酸鎂0.3 g·L-1，磷酸鈣5 g·L-1，七水硫酸亞鐵0.03 g·L-1， 一水硫酸錳0.03 g·L-1， 瓊脂20 g·L-1，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.4～7.6。

R2A 液體培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，酸水解酪蛋白胨0.5 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，淀粉0.5 g·L-1，磷酸氫二鉀0.3 g·L-1，丙酮酸鈉0.3 g·L-1，七水硫酸鎂0.05 g·L-1，TES 2 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤細(xì)菌分離 稱取土樣1 g，加入100 mL，無菌水，放入搖床中振蕩30 min，靜置至土壤全部沉淀，吸取上清液依次按照1∶10 的比例稀釋。 取土壤懸浮液100 μL， 分別涂布在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度的稀釋液做3 組重復(fù)，倒置放入培養(yǎng)箱中，在28 ℃條件下，培養(yǎng)3～5 d。挑取形態(tài)不同的單一菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的16S rDNA 的鑒定及其同源性分析按照試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit（China）的操作步驟提取DNA。 取細(xì)菌培養(yǎng)液3 mL，10 000 r·min-1離心1 min，吸上清液。 向沉淀物中加入200 μL 緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。 向離心管中加入20 μL proteinase K 溶液，混勻。加入緩沖液GB 220 μL，振蕩15 s，在70 ℃水浴鍋中放置10 min，待離心管中溶液變清澈后， 短暫離心。 加入無水乙醇220 μL，振蕩15 s。將之前獲得的溶液及絮狀沉淀加入到一個(gè)CB3 吸附柱中，然后放入離心管中，12 000 r·min-1離心30 s， 倒掉廢液， 將吸附柱放入收集管中。 向CB3 吸附柱中加入緩沖液GD 500 μL，12 000 r·min-1離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 向CB3 吸附.柱加入漂洗液PW 500 μL，12 000 r·min-1離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 將吸附柱放入收集管中，12 000 r·min-1離心2 min，倒掉廢液，將CB3 吸附柱置.于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附柱中的漂洗液。 將CB3 吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中， 向吸附膜的中間懸空滴加洗脫緩沖液TE 120 μL， 室溫靜置5 min，12 000 r·min-1離心2 min，將溶液收集到離心管中。 至此對細(xì)菌DNA 提取完成。 接下來對菌株的16S rDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。 菌株的16S rDNA 基因擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物27F 和1492R。 PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序得到的16S rDNA 序列通過Blast-n （Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query(nih.gov)）與Nucleotidecollection（Home-Nucleotide-NCBI（nih.gov））數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用MEGA 6.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的溶磷能力測定 將分離純化的溶磷菌接種至R2A 液體培養(yǎng)基中， 待菌株濃度生長至1×108CFU·mL-1時(shí)， 按1%接種量接種至無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中， 放入溫度為28.5 ℃， 轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。 吸取上清液10.00 mL 于25 mL 比色管中， 緩慢加入鉬銻抗顯色劑5.00 mL，緩慢搖動(dòng)，排出二氧化碳后，加水定容至25.00 mL，充分搖勻。 在室溫高于20 ℃處， 放置30 min， 用1 cm 光徑玻璃比色皿在波長880 nm 處比色，測量吸光度。

吸取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液 （磷標(biāo)準(zhǔn)使用液）0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL， 于25 mL 色管中，加入NaHCO3浸提劑10.00 mL， 鉬銻抗顯色劑5.00 mL，慢慢搖動(dòng)，排出二氧化碳，后加水定容至25.00 mL。此系列溶液中磷的濃度依次為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 μg·mL-1。 將溶液放置在室溫高于20～30 ℃處，放置30 min，用1 cm 光徑玻璃比色皿在波長880 nm 處比色，用系列溶液的零濃度調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，測量吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。 計(jì)算公式如下：

有效磷測定值（mg·kg-1）=（ρ×V×D）/（m×103）×103式中，ρ 為溶液中磷的質(zhì)量濃度 （μg·mL-1）；V 為顯色液體積，25 mL；D 為分取倍數(shù)， 即試樣提取液體積/顯色時(shí)分取體積，本試驗(yàn)為50/10；M 為風(fēng)干試樣質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌的篩選

本研究從遼寧省彰武縣樟子松固沙林地土壤樣本中共分離獲得3 株具有較強(qiáng)溶磷能力的細(xì)菌，其編號分別為30-3、30-4 和36-5（表1）。 其中，菌株30-3 和30-4 的溶磷能力較強(qiáng)， 溶磷量均為37.63 mg·L-1；菌株36-5 的溶磷能力相對較弱，其溶磷量為32.24 mg·L-1。本研究分離到的菌株都是常見的具有溶磷能力的菌屬，溶磷能力屬于中等水平。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)16S rDNA 的測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對， 對菌株30-3、30-4、36-5 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹（圖1）。 由圖1 可知，菌株30-3 與Bacillus aryabhattai處于同一分支，親緣關(guān)系較近，其序列同源性為99%；菌株30-4 與Paenibacillus tyrfis處于同一分支，親緣關(guān)系較近，其序列同源性為99%；菌株36-5 與Rhizobium jaguaris處于同一分支， 親緣關(guān)系較近， 其序列同源性為99%。 因此，3 株菌株分屬芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和根瘤菌屬（Rhizobium）。

圖1 基于16SrDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

本研究對遼寧省彰武縣樟子松固沙林土壤中的可培養(yǎng)溶磷細(xì)菌進(jìn)行分離純化和鑒定， 獲得3 株具有較強(qiáng)溶磷能力的細(xì)菌， 其編號和近緣種分別為30-3（Bacillus aryabhattai）、30-4（Paenibacillustyrfis）和36-5（Rhizobium jaguaris）。 藺寶珺等[13]從高寒草甸土壤中分離出數(shù)量最多的溶磷菌為芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）；孟建宇等[14]從內(nèi)蒙古荒漠灌木根內(nèi)分離出12 株具有溶磷能力的菌株，其中有5 株細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬 （Bacillus.sp）， 占分離總菌株數(shù)的41.67%；孟建宇等[15]從內(nèi)蒙古鄂爾多斯荒漠5 種灌木根際土中分離出62 株具有溶磷能力的細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）為優(yōu)勢屬，占分離總菌株數(shù)的17.74%。 本研究也分離得到一株芽孢桿菌，說明芽孢桿菌屬可能在溶磷菌中占有較大的百分比。 本研究結(jié)果表明， 菌株30-3 （Bacillus aryabhattai）和30-4（Paenibacillus tyrfis）具有較強(qiáng)的溶磷能力，且溶磷量都為37.63 mg·L-1； 菌株36-5（Rhizobium jaguaris）也具有一定的溶磷能力，其溶磷量為32.24 mg·L-1，說明芽孢桿菌屬（Bacillus）與類芽孢桿菌屬（Paenibacillus） 的溶磷能力可能強(qiáng)于根瘤菌屬（Rhizobium）。 有研究表明，Bacillus對難溶性磷酸鹽的溶解量為647.8 mg·L-1， 溶解有機(jī)磷的溶磷量為26.6 mg·L-1[16]。陳俊等[17]從紅樹林植物根際中分離出Paenibacillus ginsengagri，溶磷量為52.88 mg·L-1。 李劍鋒等[18]從蘭州市西北部屬溫帶半干旱大陸性氣候分離出Rhizobiumsp.，溶磷量為6.98 mg·L-1。通過以上的研究結(jié)果對比可知， 篩選出來的溶磷菌溶磷能力差異可能與其生存環(huán)境有關(guān)。 有研究表明，Bacillus除了具有溶磷作用之外，還具有一定的耐鹽性，可在20%NaCl 濃度下生長[19]。周妍等[20]發(fā)現(xiàn)，從綠豆根際土中分離的溶磷菌能夠促進(jìn)植物在鹽脅迫下生長。 閆楊等[21]發(fā)現(xiàn)，Bacillus對土壤關(guān)鍵酶活性有一定的影響；Paenibacillus具有解鉀能力[22]，可以分泌植物體內(nèi)重要的激素-吲哚乙酸 （IAA）[23]，IAA不僅可以促進(jìn)植物生長同時(shí)可以增強(qiáng)植物干旱脅迫抗性[24]。 王志剛等[25]從齊齊哈爾龍江縣辣椒根際土中得到3 株具有產(chǎn)IAA 能力的溶磷菌；Rhizobium具有耐堿能力[26]以及固氮能力[27]。根據(jù)16S rDNA的測序結(jié)果與NCBI BLAST 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對， 對菌株30-3、30-4 和36-5 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹， 本研究發(fā)現(xiàn)菌株30-3 與Bacillusaryabhattai親緣關(guān)系較近；菌株30-4 與Paenibacillus tyrfis親緣關(guān)系較近； 菌株36-5 與Rhizobium jaguaris親緣關(guān)系較近。 吳倩倩等[28]在荒漠地區(qū)錦雞兒屬植物中篩選出Bacillus，且是6 種不同錦雞兒內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌群。 李麗[29]從中國西北地區(qū)分離到159 株根瘤內(nèi)生細(xì)菌， 其中Paenibacillus有31 株，而且除了具有溶磷能力之外還具有產(chǎn)蛋白酶的能力；Rhizobium有25 株，除了具有溶磷能力之外，還具有固氮的能力，對植物生長都有著積極的影響，但是其能力是隨機(jī)的而且不穩(wěn)定。 綜上所述，土壤中存在具有溶磷能力的細(xì)菌，這些溶磷菌不僅可以提高土壤中可溶磷的含量，同時(shí)還能通過分泌自身代謝產(chǎn)物來促進(jìn)植物生長，并提高植物的抗逆能力。

本研究從遼寧省彰武縣樟子松固沙林中分離出3 株溶磷細(xì)菌， 編號分別為30-3、30-4 和36-5，其最近緣物種分別為Bacillus aryabhattai、Paenibacillus tyrfis和Rhizobium tropici， 經(jīng)過測定均具有較強(qiáng)的溶磷能力。由此可知，遼寧省彰武縣樟子松固沙林土壤中具有較多種類的溶磷細(xì)菌， 將溶磷菌用于微生物肥料， 可為微生物磷肥的生產(chǎn)和開發(fā)提供菌種資源， 為解決樟子松人工固沙林土壤可溶磷含量低的問題提供理論依據(jù)， 對促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。