添加不同生物炭對人工窖泥培養(yǎng)微生物群落影響

陳思恒,寧欣強(qiáng),2*,唐棠,羅惠波,2,鄭佳,李華志,甘元甲

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 自貢,643000)2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓,644000)3(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓,644000)4(資中縣銀山鴻展工業(yè)有限責(zé)任公司,四川 內(nèi)江,641000)5(四川佳樂酒業(yè)股份有限公司,四川 瀘州,646000)

中國白酒,作為世界六大蒸餾酒之一,以其獨(dú)一無二的風(fēng)味著稱于世[1]。濃香型白酒作為白酒四大香型之一,具有窖香濃郁、綿柔醇厚、香味協(xié)調(diào)等特點(diǎn)[2]。窖池作為白酒釀造的容器,窖泥中含有己酸菌、甲烷菌等多種功能微生物,通過這些微生物的代謝活動,賦予了濃香型白酒獨(dú)特的風(fēng)味;這使窖泥成為濃香型白酒生產(chǎn)中最關(guān)鍵的部分之一,因此優(yōu)質(zhì)人工窖泥的培養(yǎng)成為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)白酒的前提[3-4]。目前人工窖泥培養(yǎng)研究主要包括窖泥配方優(yōu)化、外源制劑添加、微生物作用機(jī)制和預(yù)防窖泥老化和復(fù)壯等方面[5]。但人工窖泥培養(yǎng)過程還存在水分易流失、營養(yǎng)物質(zhì)利用率低、功能菌富集較慢等問題[6]。因此,加快培養(yǎng)的人工窖泥向優(yōu)質(zhì)老窖泥轉(zhuǎn)化,提高人工窖泥培養(yǎng)質(zhì)量具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

生物炭常作為土壤改良劑,其對土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)具有較大的影響。而人工窖泥一般選用黃泥作為基質(zhì),與土壤有一定的相似性。生物炭是一種在缺氧狀態(tài)下高溫分解得到的比表面積大、孔隙發(fā)達(dá)且富含碳素的生物質(zhì)炭,被廣泛運(yùn)用于環(huán)境等領(lǐng)域[7-8]。人工窖泥培養(yǎng)過程添加生物炭預(yù)期能夠提高碳氮比,改善窖泥含水量、pH,進(jìn)而調(diào)節(jié)窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)。在人工窖泥培養(yǎng)過程中,生物炭的孔隙能定植微生物細(xì)胞并且能保住水分[9-10],高堿度可以延緩窖泥pH過度降低,豐富的表面含氧官能團(tuán)(oxygenated functional groups,OFGs)能促進(jìn)電子遷移,加快微生物生長代謝活性,增強(qiáng)生物量及酶活性[11];另外生物炭富含大量羧、醇羥基等,能進(jìn)一步提高窖泥保水性[12],加快人工窖泥向優(yōu)質(zhì)老窖泥轉(zhuǎn)化。生物炭原料在結(jié)構(gòu)、內(nèi)含物等方面存在差別,不同原料高溫裂解后在結(jié)晶度、交聯(lián)和分支等結(jié)構(gòu)特征上差異顯著[13]。竹子等生物炭木質(zhì)素含量高,炭化后大孔徑結(jié)構(gòu)多;而秸稈類生物炭由于纖維素含量高,炭化后結(jié)構(gòu)以微孔為主,相比竹子生物炭,其灰分含量、礦物質(zhì)種類和pH略高。另在碳含量上,秸稈生物炭一般為40%～80%,其他生物炭一般為60%～85%[14]。所以不同種類的生物炭在理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有明顯差異,故有必要針對不同來源的生物炭對人工窖泥培養(yǎng)過程影響進(jìn)行研究。

本研究選用宜賓本地某酒廠窖泥培養(yǎng)原料,在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)人工窖泥,分析添加丟糟生物炭(馬弗爐燒制ZM、熱解氣化燒制ZR)、玉米秸稈生物炭(YM)、稻殼生物炭(DK)、水稻秸稈生物炭(SD)、竹生物炭(ZT)6種不同生物炭和不添加生物炭(B)的人工窖泥,在培養(yǎng)開始和結(jié)束(90 d)時微生物群落結(jié)構(gòu)、內(nèi)部菌屬相關(guān)性、理化與微生物相關(guān)性的差異。對微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,解讀生物炭添加對人工窖泥培養(yǎng)過程微生物種群結(jié)構(gòu)的影響,為生物炭加快人工窖泥向優(yōu)質(zhì)老窖泥轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)人工窖泥材料均選取宜賓本地某酒廠;生物炭材料丟糟生物炭(馬弗爐燒制、熱解氣化燒制)、玉米秸稈生物炭、稻殼生物炭、水稻秸稈生物炭、竹子生物炭(具體參數(shù)見表1);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 生物炭來源及主要特征參數(shù)

1.2 儀器與設(shè)備

PHB-4型pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;7890A氣相色譜儀,美國Agilent公司;LRH-250恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TG-10臺式離心機(jī),四川蜀科儀器有限公司;101型鼓風(fēng)干燥箱,北京中興偉業(yè)儀器有限公司;T6新世紀(jì)分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;RR224ZH/E電子分析天平,奧豪斯儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物炭添加量及窖泥樣本采集

各種生物炭添加量均為15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),采用五點(diǎn)取樣法對窖泥進(jìn)行采樣,原始窖泥樣本標(biāo)記為B_S;培養(yǎng)90 d后,未添加生物炭空白組窖泥樣本標(biāo)記為B_E;添加丟糟生物炭(馬弗爐燒制和熱解氣化燒制)、玉米秸稈生物炭、稻殼生物炭、水稻秸稈生物炭、竹子生物炭的窖泥樣本分別標(biāo)記為ZM_E、ZR_E、YM_E、DK_E、SD_E、ZT_E。

1.3.2 理化性質(zhì)分析

樣品預(yù)處理:將1 g窖泥加入10 mL水中,充分搖勻,8 000 r/min離心10 min,將上清液通過20 μm濾膜轉(zhuǎn)移至離心管中儲存在冰箱中備用,即為樣品液。

采用烘干干燥法測定窖泥含水量;使用pH計測定窖泥pH值[15];采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)測定窖泥銨態(tài)氮含量;采用修正的Folin-Lowry法測定窖泥腐殖質(zhì)含量[16];采用比色法測定窖泥有機(jī)酸含量[17]。采用固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)檢測窖泥己酸含量。取1 g窖泥樣品于25 mL頂空瓶中,加入5 mL超純水2 g NaCl,再加入50 μL乙酸正丁酯(色譜純)作為內(nèi)標(biāo),混勻后超聲振蕩30 min。用萃取針在50 ℃下萃取30 min。GC條件:不分流,進(jìn)樣口溫度230 ℃;升溫程序:40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升溫至100 ℃不保持,以6 ℃/min升溫至230 ℃保持10 min;MS條件:傳輸線溫度230 ℃,電離方式為電子電離源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃。

1.3.3 宏基因組提取和微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

將窖泥樣品取少許于取樣管中,委托上海美吉生物科技有限公司完成DNA抽提和測序。具體操作如下,抽提DNA樣品,利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA,并對DNA抽提產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化。采用熒光定量對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析和均一化,建立PE文庫并Illumina MiSeq雙端測序,得到原始序列。其中16S rRNA擴(kuò)增子引物對為515 FmodF:5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′,和806RmodR:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′,擴(kuò)增區(qū)為16S rRNA的V4區(qū)[18-19]。

采用軟件對測序原始序列進(jìn)行質(zhì)控,包括序列拼接,去除含有N的序列、引物、接頭、質(zhì)量值低于20的堿基、長度低于200 bp的序列及嵌合體序列得到有效序列。使用軟件對有效序列進(jìn)行分類,通過Illumina MiSeq平臺,ASV分析流程對數(shù)據(jù)處理分析,并在物種分類水平統(tǒng)計每個樣本的微生物群落組成。利用ASV分析結(jié)果,計算Shannon、Chao1等α多樣性指數(shù)與冗余分析(redundancy analysis,RDA)等β多樣性分析[15]。并完成后續(xù)的微生物群落分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

對培養(yǎng)90 d后人工窖泥理化參數(shù)作顯著性分析(P<0.05),結(jié)果如表2所示。生物炭添加顯著影響窖泥pH、含水量、腐殖質(zhì)等。添加SD、YM,窖泥的pH顯著提高(相比空白組高0.40和0.39),這主要是由于生物炭有較高的堿度,延緩了pH的降低。添加ZM、SD、DK窖泥含水量顯著高于空白組窖泥,含水量分別提高了 4.02%、2.13%、0.68%,主要是因生物炭表面有大且豐富的孔徑和醇羥基等結(jié)構(gòu)鎖住窖泥部分水分,提高窖泥的保水性。添加生物炭窖泥腐殖質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)利用率顯著提高,是由于生物炭富含OFGs,促進(jìn)種間電子傳遞,微生物代謝加快所致。

表2 人工窖泥樣品理化參數(shù)

2.2 α多樣性分析

如表3所示,培養(yǎng)90 d后的窖泥樣本較原始樣本豐富度指數(shù)(Chao1)降低。相較新窖泥,優(yōu)質(zhì)老窖泥Chao1指數(shù)會有一定程度的下降,表明人工窖泥在向老窖泥轉(zhuǎn)化[20-21]。除YM和DK組外,其他生物炭添加組的物種豐富度均高于空白窖泥樣本,添加SD窖泥Chao1指數(shù)相比空白組提高幅度達(dá)9.15%。除ZM組外,其余組窖泥多樣性均下降。添加ZM、SD、ZR、ZT窖泥多樣性Shannon指數(shù)比空白組高18.52%、12.15%、8.15%和4.81%,其中ZM組窖泥多樣性最高。各組窖泥樣品多樣性指數(shù)隨著窖齡增加總體呈上升趨勢[22],且趨近于優(yōu)質(zhì)窖泥的多樣性指數(shù)(Shannon 5.50～6.45)[15]。表明添加生物炭,能夠使適應(yīng)環(huán)境的微生物種群得到更好的富集并成為穩(wěn)定的優(yōu)勢種群[23]。這可能是由于生物炭擁有豐富的多孔結(jié)構(gòu)和OFGs,提高了人工窖泥豐富度和多樣性的同時,加快微生物的富集。

2.3 β多樣性分析

如圖1-a所示,所有窖泥在屬水平上共有55種。其中主要是Caproiciproducens(19.87%)、Clostridium_sensu_stricto_12(16.26%)為己酸菌和梭狀芽孢桿菌(圖1-b)。說明這共有屬如Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12是窖泥中重要的功能微生物,共同主導(dǎo)窖泥培養(yǎng)的正常進(jìn)行。

如圖2所示,添加生物炭后人工窖泥優(yōu)勢功能微生物屬得到富集,重要的功能優(yōu)勢古生菌Methanosarcina[22,24]也得到富集。對比空白組窖泥,除YM組外,其他添加生物炭組窖泥Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12等優(yōu)勢功能菌屬相對豐度都有明顯增加。對比不同生物炭,添加DK窖泥組的Caproiciproducens菌屬、DK、ZM、ZR窖泥Clostridium_sensu_stricto_12菌屬均高于空白和原始組窖泥樣本。同時Lactobacillus菌屬相對含量較空白組都有降低,添加ZM窖泥Lactobacillus菌屬相對豐度更少,這是由于己酸菌、梭菌產(chǎn)生己酸等抑制了部分Lactobacillus生長[25]。說明添加ZM組窖泥微生物富含較為豐富的Caproiciproducens外,有利于Clostridium_sensu_stricto_12和Methanosarcina等優(yōu)勢菌生長,同時抑制Lactobacillus生長效果更明顯,能加快人工窖泥向優(yōu)質(zhì)老窖泥轉(zhuǎn)化。這可能是生物炭擁有豐富的OFGs,促進(jìn)了種間電子傳遞,加快了微生物生長代謝。

圖2 各窖泥樣品中相對豐度前50屬水平微生物種群柱狀圖

通過熱圖進(jìn)一步分析窖泥微生物屬種,結(jié)果如圖3所示。所有微生物屬分別隸屬于8個門,主要分布在Firmicutes。其中Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Lactobacillus為窖泥中的優(yōu)勢菌屬,與已報道四川酒企的窖泥中優(yōu)勢菌屬類有高度的一致性[15]。

圖3 各樣品窖泥相對豐度前50屬水平微生物種群熱圖

如圖3所示,聚類分析結(jié)果表明,原始窖泥樣本為單獨(dú)一大簇(Ⅰ),培養(yǎng)后的窖泥為另一大簇(Ⅱ)。培養(yǎng)90 d后YM、SD分為一個亞簇,ZM、DK、ZR分為一個亞簇,B、ZT又分為一個亞簇。表明窖泥培養(yǎng)后在微生物屬種上具有差異性。除ZT外,其他生物炭添加窖泥組較空白組在微生物屬種上差異顯著。原始窖泥樣本中存在豐度較高的norank_f__norank_o__Chloroplast等微生物屬,在窖泥研究的文獻(xiàn)中其功能并不明確。在添加生物炭培養(yǎng)后,這類微生物相對含量明顯減少甚至消失。添加ZM、DK、ZR窖泥培養(yǎng)后有相似的微生物組成,與Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12有較強(qiáng)的相關(guān)性,與Myxococcus和Sporosarcina菌屬則呈顯著負(fù)相關(guān)。YM、SD窖泥中則與Acidipropionibacterium和Weissella等菌呈著正相關(guān),表明添加ZM、DK、ZR的窖泥與釀酒重要優(yōu)勢功能微生物有更強(qiáng)相關(guān)性,和Lactobacillus相關(guān)性更弱。此類生物炭表面孔徑更豐富更密集,表面OFGs更多,對人工窖泥理化性質(zhì)和微生態(tài)環(huán)境調(diào)節(jié)效果更好,更有利于加快人工窖泥向優(yōu)質(zhì)老窖泥轉(zhuǎn)化。

2.4 窖泥微生物群落網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析

根據(jù)Spearman相關(guān)性(|ρ|>0.6,P<0.05),分析分類學(xué)總豐度前50的物種,結(jié)果如圖4-a所示。這些微生物共49個節(jié)點(diǎn),所有節(jié)點(diǎn)都隸屬于8個門,主要集中在Firmicutes,占所有節(jié)點(diǎn)的71%。各窖泥樣品中共存在5個樞紐,都屬于Firmicutes,在網(wǎng)絡(luò)中十分重要(圖4-a)。在添加生物炭培養(yǎng)后,窖泥中微生物分為了2個模塊,其中1個是以Firmicutes為主的主體部分,占了網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性中絕大部分,Clostridium_sensu_stricto_12和Caproiciproducens在網(wǎng)絡(luò)中最為重要,它們都是己酸菌且呈正相關(guān),這與已有文獻(xiàn)報道一致[22]。添加生物炭不會使窖泥微生態(tài)穩(wěn)定性變差或退化,不會受到Lactobacillus等微生物對窖泥網(wǎng)絡(luò)平衡造成的影響。

a-水平微生物網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性圖;b-共線性網(wǎng)絡(luò)圖

共線性網(wǎng)絡(luò)如圖4-b所示,不同生物炭添加,對培養(yǎng)后人工窖泥中微生物組成會造成明顯差異。原始窖泥樣本獨(dú)有屬種種類較多,添加生物炭會抑制這些微生物生長,并促進(jìn)Caproiciproducens、Clostridium、Bacillus、Methanobacterium等菌屬富集。添加ZM窖泥組與Clostridium_sensu_stricto_19、Roseburi和g__unclassified_o__norank_c__Clostridia有較強(qiáng)的相關(guān)性,此類微生物都是在釀酒過程中能起到重要作用的梭菌。ZR、ZT窖泥組與Clostridium_sensu_stricto_11有較強(qiáng)的相關(guān)性。DK則沒有與特有的功能微生物有強(qiáng)相關(guān)性,多樣性不強(qiáng)。這可能是由于ZM等擁有更豐富的OFGs增強(qiáng)了種間電子傳遞效率,富集了更多種類的釀酒功能微生物。同時也表明己酸菌作為窖泥中關(guān)鍵的微生物,能聯(lián)系其他微生物從而帶動整個窖泥正常運(yùn)行[26-27]。

2.5 窖泥微生物群落與理化因子相關(guān)性分析

基于窖泥核心菌群與理化性質(zhì)的RDA,結(jié)果如圖5-a所示。理化因子對RDA1和RDA2解釋度依次是pH(99.67%)>有機(jī)酸(86.05%)>腐殖質(zhì)(75.25%)>水分(49.61%),其中pH和含水量與微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)極顯著關(guān)系(P<0.01),添加不同生物炭的窖泥也被明顯區(qū)分。圖5-a表明,添加生物炭主要與pH、含水量和銨態(tài)氮等具有相關(guān)性,而pH和含水量是提高窖泥質(zhì)量的主要驅(qū)動力[28-29],添加生物炭有利于提升窖泥質(zhì)量。添加YM、SD主要影響窖泥pH,ZM、ZR主要影響窖泥含水量,DK、ZR則主要影響窖泥銨態(tài)氮和己酸。微生物影響方面,添加生物炭主要與窖泥內(nèi)Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Methanobacterium和Hydrogenispora有顯著相關(guān)性。添加ZR、ZM和DK與Clostridium_

a-冗余分析;b-熱圖

sensu_stricto_12呈正相關(guān)。ZR和DK與Caproiciproducens呈正相關(guān)。YM、SD和ZM窖泥則與Methanobacterium和Hydrogenispora呈正相關(guān)性。說明添加生物炭能影響窖泥優(yōu)勢功能微生物的生長,添加ZR、ZM和DK影響窖泥Clostridium_sensu_stricto_12菌屬的富集,ZR和DK影響窖泥Caproiciproducens菌屬的富集。同時含水量、pH、銨態(tài)氮與Lactobacillus呈負(fù)相關(guān),這與畢天然等[30]研究相符。pH及乳酸菌分別與大部分菌群和梭菌呈負(fù)相關(guān),這與吳浪濤[26]的研究相符。但銨態(tài)氮、腐殖質(zhì)與窖泥細(xì)菌有較強(qiáng)的相關(guān)性,與pH、含水量有負(fù)相關(guān),這與較多學(xué)者的研究結(jié)果有差異[29-32]。

理化性質(zhì)與微生物相關(guān)性熱圖如圖5-b所示。pH、含水量和腐殖質(zhì)與微生物呈顯著相關(guān)性。pH降低與Methanobacterium呈極顯著相關(guān),而Methanobacterium產(chǎn)甲烷菌系是窖泥中功能古菌[23,33]。含水量和pH降低與Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12呈負(fù)相關(guān)性。所以pH帶來窖泥質(zhì)量的影響可能與Methanobacterium有關(guān)。添加生物炭提高窖泥保水性并延緩pH降低,較高的含水量和偏中性的pH更有利于窖泥質(zhì)量提高。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)研究添加不同生物炭對人工窖泥培養(yǎng)過程中微生物群落的影響,結(jié)果表明添加ZM窖泥含水量比空白組窖泥高4.02%,含水量提高有利于加快人工窖泥向優(yōu)質(zhì)窖泥的轉(zhuǎn)化。添加ZM窖泥Shannon指數(shù)比空白組提高18.25%,多樣性更趨近于優(yōu)質(zhì)老窖泥的多樣性指數(shù)(Shannon 5.50～6.45)。添加ZM組能保證Caproiciproducens豐富度較高情況下,促進(jìn)Clostridium_sensu_stricto_12等窖泥內(nèi)產(chǎn)己酸功能微生物富集,其相對含量較空白組提高了7.99%,同時抑制Lactobacillus等對窖泥質(zhì)量有不利影響的微生物生長,其相對含量較空白組減少了10.10%。RDA結(jié)果表明添加ZM與Clostridium_sensu_stricto_12有正相關(guān)性,且與Lactobacillus顯著負(fù)相關(guān)。本研究為生物炭應(yīng)用于人工窖泥向優(yōu)質(zhì)老窖泥轉(zhuǎn)化提供了微生物學(xué)理論基礎(chǔ)。