信號(hào)通路對(duì)Ilizarov技術(shù)牽張成骨調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展

付志斌，何國(guó)偉，陳威，譚明遠(yuǎn)，王國(guó)慧，徐玉德，周明旺

Ilizarov技術(shù)是前蘇聯(lián)Ilizarov教授發(fā)明的以張力應(yīng)力法則為理論基礎(chǔ)的骨外固定技術(shù)，被譽(yù)為20世紀(jì)骨科發(fā)展史上的里程碑之一[1]。隨著該技術(shù)的不斷推廣，其在矯形外科、修復(fù)重建、頜面外科等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。Ilizarov技術(shù)是以張力應(yīng)力法則為基礎(chǔ)的牽張成骨技術(shù)，其通過(guò)安全、緩慢的牽張，促進(jìn)骨與周圍組織的再生，從而達(dá)到治療疾病的目的。牽張成骨技術(shù)在宏觀上主要分為三個(gè)階段：潛伏期、搬移期、固化期[2]，目前已有較多研究報(bào)道；其在微觀上的作用機(jī)制研究也逐漸增多。盡管骨牽張的生物力學(xué)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)等已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，但牽張成骨調(diào)控骨生成的分子生物學(xué)機(jī)制仍不完全清楚。大量研究證實(shí)，多個(gè)信號(hào)通路在牽張成骨的過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用，在機(jī)械牽張下，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）可以特異性地遷移到成骨前沿，進(jìn)行成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)新骨形成，以響應(yīng)機(jī)械張力[3-5]。本文以Ilizarov技術(shù)牽張成骨為研究的主線，從骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-Smad/整合素（integrin）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）和Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，就信號(hào)通路對(duì)Ilizarov技術(shù)牽張成骨調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期從信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑探討Ilizarov技術(shù)牽張成骨的分子生物學(xué)機(jī)制，為肢體矯形和骨修復(fù)重建外科的研究提供新的思路。

1 Ilizarov技術(shù)機(jī)械牽張激活BMP-Smad信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化

BMP是一種特異性非膠原基質(zhì)蛋白，是成骨細(xì)胞分化成熟的一種特異性標(biāo)志物。在Ilizarov技術(shù)機(jī)械牽張促進(jìn)骨形成的過(guò)程中，BMP是重要的啟動(dòng)因素和影響因子[6]。在骨形成早期，BMP可與MSCs表面的相應(yīng)受體結(jié)合，從而刺激MSCs向成骨細(xì)胞分化，在分化的同時(shí)使成骨細(xì)胞產(chǎn)生更多的BMP。同時(shí)BMP激活其介導(dǎo)的BMP-Smad信號(hào)通路。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（bone morphogenetic protein receptor, BMPR）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）受體超家族成員，是膜蛋白受體，受體分子由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)，分為BMPR-ⅠA、BMPR-ⅠB和BMPR-Ⅱ三類[7-8]。BMP配體與異源二聚體結(jié)合可以激活Smad蛋白依賴性BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[9]。Jun等[10]在牽張成骨的研究中發(fā)現(xiàn)，BMP-2、BMP-4表達(dá)水平在早期和牽張期明顯增加，其可能的作用是促進(jìn)前體細(xì)胞分化為成軟骨/成骨細(xì)胞。

Ilizarov技術(shù)機(jī)械牽張作用不僅可以直接促進(jìn)BMP的生成，而且間接刺激其他生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，如TGF-β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor, IGF），這些因子又可以刺激MSCs分化，最終促進(jìn)骨形成[11-13]。Sumanasinghe等[14]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)MSCs施加牽張力，牽張的機(jī)械張力-應(yīng)力效應(yīng)對(duì)BMP轉(zhuǎn)錄有顯著影響，可以使BMP-2表達(dá)上調(diào)。朱曉文等[15]通過(guò)機(jī)械牽張介導(dǎo)Smad通路對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨細(xì)胞分化作用的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活與細(xì)胞受牽張應(yīng)力刺激密切相關(guān)，并與MSCs增殖與骨向分化趨勢(shì)一致。表明在Ilizarov技術(shù)機(jī)械牽張促進(jìn)骨形成的過(guò)程中，BMP-Smad通路在細(xì)胞力學(xué)信號(hào)向生物化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用。

2 整合素/mTOR和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路協(xié)同促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化

2.1 整合素信號(hào)通路

整合素信號(hào)通路是一系列蛋白組成的由眾多信號(hào)分子參與的蛋白網(wǎng)。Liu等[16]提出，機(jī)械張力刺激成骨細(xì)胞系時(shí)，整合素具有一定的作用。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)研究牽張成骨的分子機(jī)制具有重要意義。Spiteri等[17]提出，當(dāng)細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力刺激時(shí)，整合素在細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架之間將力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，整合素信號(hào)通路對(duì)誘導(dǎo)BMSCs分化及新生骨的形成起著重要的調(diào)控作用。姜喜亮等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)抑制整合素信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)牽張成骨中BMSCs的骨向分化及成骨作用減弱，提示整合素信號(hào)通路在牽張成骨過(guò)程中具有調(diào)控作用。該課題組還在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)整合素β1在將胞外的張應(yīng)力刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)生化信號(hào)的過(guò)程中扮演著重要角色[19]。

2.2 mTOR信號(hào)通路

mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞分裂及MSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中具有重要的調(diào)控功能[20]。Nakai等[21]在動(dòng)物的牽張成骨實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用牽張裝置對(duì)截骨段施加一定的牽張力，發(fā)現(xiàn)骨斷端間隙內(nèi)成骨細(xì)胞mTOR信號(hào)通路被激活，PCR檢測(cè)mTOR基因表達(dá)水平明顯升高，成骨細(xì)胞功能增強(qiáng)，骨折愈合加快。楊子檜等[22]通過(guò)大鼠體內(nèi)牽張成骨模型及體外MSCs-成骨細(xì)胞系牽張模型，發(fā)現(xiàn)牽張組骨斷端新生骨痂中p-mTOR表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；而且PCR結(jié)果顯示，牽張組mTOR表達(dá)上調(diào)，牽張應(yīng)力可激活mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)MSCs-成骨細(xì)胞系遷移，增強(qiáng)組織成骨能力。更有研究者發(fā)現(xiàn)，mTOR可促進(jìn)MSCs的骨向分化，體內(nèi)及體外應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素可以抑制成骨[23-24]。體外牽張應(yīng)力可激活成骨細(xì)胞mTOR信號(hào)通路，使mTOR表達(dá)水平升高[21,25]。

2.3 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路

Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、存活及癌變等過(guò)程中起著重要作用，尤其在骨骼發(fā)生、再生的各個(gè)階段。Zhou等[26]通過(guò)CKIP-1基因沉默大鼠牽張成骨研究發(fā)現(xiàn)，CKIP-1基因沉默可促進(jìn)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)分子的表達(dá)，誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，促進(jìn)新骨生成。胡靜等[27]通過(guò)構(gòu)建大鼠牽張成骨模型，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白分子Wnt3A及β-連環(huán)蛋白在牽張骨痂成骨細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)，停止?fàn)繌?周后其表達(dá)水平顯著降低，結(jié)果證實(shí)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路參與牽張成骨全過(guò)程，機(jī)械應(yīng)力刺激引起牽張間隙內(nèi)生物學(xué)改變。趙闖等[28]通過(guò)分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，應(yīng)用自行研制的多單元細(xì)胞拉伸裝置，對(duì)BMSCs予以機(jī)械張應(yīng)力刺激，從而激活Wnt信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張刺激增強(qiáng)BMSCs增殖與成骨分化。

2.4 信號(hào)通路的協(xié)同作用

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有大量的細(xì)胞因子參與這個(gè)過(guò)程，其中BMSCs起著重要的作用，其有較強(qiáng)的增殖能力和向多種MSCs分化的潛能，能夠向成骨細(xì)胞分化[29]。所以在骨折愈合和骨不連的研究中，BMSCs相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究的報(bào)道較多，研究結(jié)果均證實(shí)BMSCs在骨折愈合中扮演重要的角色[30-33]。BMP是TGF-β超家族中的多功能生長(zhǎng)因子，在MSCs形成骨祖細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用[34]。在Ilizarov技術(shù)牽張成骨中，BMP-Smad信號(hào)通路是最早發(fā)揮作用的啟動(dòng)通路，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路是BMSCs分化的經(jīng)典途徑[21]，主要由細(xì)胞外分泌蛋白Wnt家族細(xì)胞膜上的跨膜受體、胞質(zhì)內(nèi)的降解復(fù)合體和β-連環(huán)蛋白等組成。姜喜亮等[18]發(fā)現(xiàn)，抑制整合素信號(hào)通路可以減弱牽張成骨中BMSCs骨向分化及成骨作用，提示整合素信號(hào)通路在牽張成骨過(guò)程中具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，牽張應(yīng)力很可能激活MSCs-成骨細(xì)胞系mTOR信號(hào)通路，使基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2、MMP-9、MMP-13的表達(dá)水平升高，進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)MSCs-成骨細(xì)胞系的遷移[22,35]。Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)，整合素連接激酶（integrin-linked kinase, ILK）除了參與整合素信號(hào)通路外，還可能影響生長(zhǎng)因子信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路，并且提出BMSCs對(duì)力學(xué)刺激較為敏感，恒定的微小外力可誘發(fā)BMSCs增殖分化。BMSCs在生理?xiàng)l件下保持靜息狀態(tài)，為BMSCs龕控制，而不是在組織中游離，MSCs龕以MSCs、整合素、血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)為微環(huán)境的主要成分[37-38]；在外界刺激（創(chuàng)傷等病理?xiàng)l件和應(yīng)力等）可使骨組織中的BMSCs處于動(dòng)態(tài)。牽張刺激使BMSCs發(fā)揮作用，主要通過(guò)擾動(dòng)、影響細(xì)胞外基質(zhì)剛度和改變細(xì)胞剛性三種形式，符合三種形式中的任何一種就可以使BMSCs脫龕[39]。BMSCs生物學(xué)效能的發(fā)揮以BMSCs脫龕后遷移至成骨部位為前提，從而進(jìn)行成骨細(xì)胞分化，牽張應(yīng)力下的牽張成骨過(guò)程同樣如此[31]。根據(jù)以上信號(hào)通路的途徑及作用機(jī)制可以推測(cè)，在Ilizarov技術(shù)牽張成骨的過(guò)程中，BMP-Smad/整合素/mTOR和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路具有協(xié)同作用，可協(xié)同促進(jìn)BMSCs成骨分化，增強(qiáng)牽張應(yīng)力成骨的效能。

3 小結(jié)

Ilizarov技術(shù)牽張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)BMSCs遷移至成骨前沿，分化形成成骨細(xì)胞，達(dá)到骨再生和修復(fù)骨缺損的作用。在這一過(guò)程中，BMP是重要的啟動(dòng)因素和影響因子，該因子介導(dǎo)的BMP-Smad信號(hào)通路也成為最先的啟動(dòng)通路。在Ilizarov技術(shù)牽張應(yīng)力刺激下，整合素、mTOR和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路均具有促進(jìn)MSCs增殖與骨向分化趨勢(shì)，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明此結(jié)果，但是還需要大量的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突