脛骨橫向搬移技術(shù)的臨床應(yīng)用及其誘導(dǎo)血管再生機制的研究進(jìn)展

徐道非，胡蓉，余慶龍，廖龍，張?zhí)希嗔?，張定偉，石?/p>

脛骨橫向搬移（tibial transverse transport, TTT）技術(shù)基于Ilizarov技術(shù)的張力應(yīng)力法則，于脛骨中上段制造搬移骨塊，安裝橫向骨搬移外固定器，雙向緩慢調(diào)整外固定器，橫向搬移骨塊，促進(jìn)搬移區(qū)域血管再生，改善下肢血供。CT血管成像（computed tomography angiography, CTA）發(fā)現(xiàn)，糖尿病足患者骨搬移區(qū)域及肢體遠(yuǎn)端新生大量毛細(xì)血管[1]。TTT技術(shù)雖然已被證實可改善下肢血供、促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合、降低截肢風(fēng)險、提高生活質(zhì)量，但其介導(dǎo)血管再生的機制尚不明確，本文總結(jié)了TTT技術(shù)直接或間接刺激血管生成的潛在驅(qū)動因素，為后續(xù)研究提供參考。

1 TTT技術(shù)

1.1 TTT技術(shù)概述

TTT技術(shù)源于Ilizarov技術(shù)張力應(yīng)力法則，其原理為緩慢持續(xù)向同一方向牽拉刺激牽拉區(qū)域血管、肌肉和骨的再生。TTT技術(shù)于脛骨中上段制造搬移骨塊并進(jìn)行持續(xù)的橫向搬動，促進(jìn)新生血管和骨組織形成，改善肢體血液供應(yīng)，從根本上消除下肢缺血性疾病的根源，促進(jìn)血液循環(huán)，從而在臨床治療中發(fā)揮作用[2]。TTT技術(shù)可促進(jìn)血運重建，有效改善下肢血供，促進(jìn)下肢潰瘍的愈合。有研究顯示TTT技術(shù)治療Wagner 4級糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer,DFU），術(shù)后1年患者傷口愈合率和保肢率均為94.74%，血管造影顯示下肢動脈增粗，血管網(wǎng)較前豐富[3]。與傳統(tǒng)治療相比，TTT技術(shù)顯著提高了DFU治療后2年的潰瘍愈合率、保肢率、血管再通率、血流量等指標(biāo)[4]。

1.2 血管生成

充足的血液供應(yīng)在傷口愈合中起著重要作用。血管造影證實，在骨搬移的過程中，搬移區(qū)域新生了大量毛細(xì)血管[5]。血管生成定義為新的毛細(xì)血管從先前存在的脈管系統(tǒng)中生長出來，發(fā)生及發(fā)育的過程[6]。血管生成反應(yīng)是最早被確定對傷口修復(fù)至關(guān)重要的過程之一[7]。傷口血運重建是一個主動過程，脈管系統(tǒng)對受傷組織的代謝需求做出反應(yīng)。在許多類型愈合不良的傷口中都發(fā)現(xiàn)了傷口血管生成障礙，包括由于衰老、糖尿病和血管疾病引起的傷口[8]。超過100項研究檢查了糖尿病患者傷口愈合中的血管生成。這些研究表明，血管生成減少是導(dǎo)致糖尿病患者傷口愈合不足的關(guān)鍵因素[9]。血管生成因子和受體的缺陷，以及內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell, EPC）數(shù)量和功能的缺陷，都被認(rèn)為是導(dǎo)致糖尿病患者傷口中血管生成反應(yīng)受損的原因[10]。糖尿病患者中發(fā)生的促血管生成階段的缺陷已在多項動物研究中成功逆轉(zhuǎn)[11]。在此類研究中，糖尿病動物模型中血管生成的改善通常與傷口閉合的改善同時發(fā)生。例如在短期實驗中，添加外源性促血管生成因子已被證明可以恢復(fù)糖尿病小鼠的血管生成并改善傷口閉合[12]。除了血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）外，大量單一療法已被證明可有效改善糖尿病小鼠模型中的糖尿病傷口愈合[11]。然而，在人類DFU中，單因素治療的效果甚微。更具體地說，沒有明確的證據(jù)表明單獨使用VEGF治療可以改善人類DFU的愈合[13]。

2 TTT技術(shù)的臨床應(yīng)用

2.1 TTT技術(shù)在糖尿病足中的應(yīng)用

DFU是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，超過15%的DFU會發(fā)展為下肢截肢[14]，且5年死亡率高達(dá)70%[15]。DFU是多因素造成的，其中外周動脈疾病和微血管功能障礙起著重要作用。血管病變不僅會導(dǎo)致足部潰瘍，還會導(dǎo)致隨后的愈合失敗和截肢[16]。既往DFU的治療包括外科清創(chuàng)、血運重建（血管內(nèi)介入、血管旁路移植）、皮瓣移植、控制感染等。這些療法由于技術(shù)復(fù)雜、臨床適應(yīng)證窄、創(chuàng)傷大、費用貴等原因難以在臨床上取得較好效果[17]。即使經(jīng)過昂貴的治療后DFU愈合，其1、3、5年的復(fù)發(fā)率分別為40%、60%和65%[14]。

TTT技術(shù)通過持續(xù)穩(wěn)定調(diào)整牽引，伴隨著豐富的血管網(wǎng)絡(luò)形成。與常規(guī)手術(shù)治療相比，該技術(shù)有利于頑固性DFU患者的傷口愈合和保肢，并發(fā)癥少且輕微，此外手術(shù)后足部可發(fā)現(xiàn)新生血管形成和灌注增加[18-19]。一項前瞻性多中心隊列研究納入1 175例患者，經(jīng)2年隨訪，最終分析的1 072例患者中，94.9%的潰瘍完全愈合，4.9%接受大截肢，3.1%經(jīng)歷復(fù)發(fā)，平均愈合時間為（12.4±5.6）周[1]。另一項多中心研究共納入201例糖尿病足患者，隨訪所有患者的傷口均完全愈合，平均愈合時間為（4.6±1.6）個月，未發(fā)生大截肢、復(fù)發(fā)及治療相關(guān)并發(fā)癥[19]。TTT的治療效果與TTT后新生血管形成和灌注增加有關(guān)。在近端脛骨牽拉期間，遠(yuǎn)端脛骨的血流量增加了7～8倍[20]。TTT技術(shù)能有效、安全地治療2型糖尿病患者的缺血性DFU，是缺血性DFU治療體系的重要組成部分[21-22]，值得進(jìn)一步研究。

2.2 TTT技術(shù)在下肢缺血性疾病中的應(yīng)用

下肢慢性缺血性疾病是由中小動靜脈狹窄或閉塞引起的四肢血液循環(huán)障礙，包括動脈硬化性閉塞癥和血栓閉塞性脈管炎等。下肢缺血性疾病是目前臨床上導(dǎo)致下肢功能障礙甚至截肢的最常見原因，下肢缺血性疾病由于自身血運障礙而致長期組織缺血，在遭受外傷等情況下，常出現(xiàn)傷口不愈合。對下肢缺血性疾病，傳統(tǒng)的治療方案很難改善傷口的潰瘍、感染，乃至發(fā)展到截肢。因此，改善下肢血供成為治療下肢缺血性疾病的關(guān)鍵。既往將TTT技術(shù)應(yīng)用于DFU的治療，取得了顯著的臨床效果（潰瘍愈合率和保肢率顯著提高，復(fù)發(fā)率降低[18]），該效應(yīng)可歸因于骨搬移介導(dǎo)的血管生成和新生血管形成后的灌注。鑒于下肢缺血性疾病與DFU有一些重要的共同發(fā)病機制（缺血），因此推測TTT技術(shù)可能有助于下肢缺血性疾病的治療。Nie等[23]的研究納入85例下肢缺血性疾病患者，根據(jù)治療方式分為TTT組（42例）和對照組（43例），TTT組患者接受TTT技術(shù)治療后進(jìn)行4周的牽引，對照組則接受傳統(tǒng)手術(shù)（清創(chuàng)、血運重建、皮瓣重建、皮膚移植或同等手術(shù)），術(shù)后1年隨訪中評估潰瘍愈合和愈合時間、保肢、復(fù)發(fā)和患者死亡率，使用CTA評估TTT組患者腿部小血管的變化，與對照組相比，TTT組創(chuàng)面、足部、同側(cè)小腿處有較多新生小血管形成，患者在更短的愈合時間內(nèi)獲得了更高的治愈率，并縮短了愈合時間。Zhao等[24]報道了22例使用TTT技術(shù)治療的血栓閉塞性脈管炎病例，在第一個治療周期內(nèi)實現(xiàn)了血栓閉塞性脈管炎相關(guān)的慢性下肢傷口愈合。兩個治療周期后所有傷口均完全愈合。經(jīng)過TTT技術(shù)治療，患者足部冷感明顯緩解，下肢靜息痛明顯緩解，激光多普勒流量計顯示患足的血流灌注和經(jīng)皮氧分壓均較術(shù)前升高。

兩項研究分別采用TTT技術(shù)治療不同類型下肢缺血性疾病，均取得較常規(guī)治療更高的傷口愈合率，并縮短了愈合時間，顯示血管網(wǎng)較治療前更豐富，提示TTT技術(shù)在改善下肢缺血性疾病血供方面有十分積極的作用。但TTT技術(shù)介導(dǎo)血運重建的機制尚不清楚，現(xiàn)有機制研究大多依托動物模型，還需進(jìn)一步擴(kuò)大研究，完善TTT技術(shù)理論基礎(chǔ)。

3 TTT技術(shù)誘導(dǎo)血管再生的機制

3.1 血管生成-成骨耦合

骨骼是一種高度血管化的組織[25]，損傷部位的血管供應(yīng)減少和營養(yǎng)供應(yīng)有限會導(dǎo)致骨骼愈合受損，這表明血管生成對于骨骼修復(fù)過程至關(guān)重要。更重要的是，越來越多的證據(jù)表明骨修復(fù)過程中血管生成和成骨過程之間存在密切的時空關(guān)聯(lián)和功能依賴性，推測為血管生成-成骨耦合[26]。將骨骼系統(tǒng)中的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)分為H型和L型。H型內(nèi)皮細(xì)胞的特點是高表達(dá)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1和內(nèi)粘蛋白，介導(dǎo)脈管系統(tǒng)的局部生長，并為血管周圍骨祖細(xì)胞提供生態(tài)位信號，增強血管生成和成骨的耦合[27]。對于骨搬移，其特點是在牽張階段出現(xiàn)血管生成，并在隨后的鞏固階段出現(xiàn)新骨生成，這表明在骨搬移過程中存在血管生成-成骨耦合。近年來，隨著對血管生成-成骨耦合作用認(rèn)識的積累，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）在骨再生中的關(guān)鍵作用得到進(jìn)一步探討。一方面，骨內(nèi)毛細(xì)血管系統(tǒng)的物質(zhì)供應(yīng)和信號調(diào)節(jié)功能很大程度上致力于改善BMSCs的募集和成骨分化[28]；另一方面，由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的成骨細(xì)胞也被認(rèn)為是H型內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞[29]。Shen等[30]首先證實了大鼠牽引成骨術(shù)（distraction osteogenesis, DO）模型中H型血管的存在，并發(fā)現(xiàn)DO模型中的H型血管更多。這是首次報道DO模型中存在H型血管，并且證明規(guī)律的拉應(yīng)力可以刺激H型血管的形成。同時，包括放射、免疫組織化學(xué)和免疫熒光分析在內(nèi)的體內(nèi)結(jié)果表明，H型血管豐度較高的群體表現(xiàn)出更好的血管生成和成骨結(jié)果，這可能與H型血管介導(dǎo)骨血管生長的獨特分子特性有關(guān)[30-31]。緩慢持續(xù)牽拉骨塊可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化和促血管生成潛力，促進(jìn)骨中的血管生成-成骨耦合，其機制有待在臨床實踐中進(jìn)一步研究。

3.2 促血管生成相關(guān)因子

3.2.1 EPC

EPC與DO過程密切相關(guān)。據(jù)報道，DO將EPC從骨髓動員到外周血中，將它們引導(dǎo)至牽引間隙，可能有助于大鼠脛骨DO模型中的血管生成和骨再生[32]。Lee等[33]報道了接受肢體延長的患者在DO期間EPC的動員，并伴有血漿VEGF和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1水平升高。Jia等[34]通過超速離心從大鼠骨髓EPC中分離外泌體。使用68只Sprague-Dawley大鼠建立單側(cè)脛骨DO模型，持續(xù)牽引10 d，牽張后將內(nèi)皮祖細(xì)胞來源外泌體（EPC derived exosomes, EPC-Exos）局部注射到牽張間隙中，分析評估EPC-Exos對骨再生和血管生成的治療效果，并通過體外測定評估EPC-Exos的促血管生成作用和潛在機制。X線、CT和組織學(xué)分析表明，接受EPC-Exos治療的大鼠的骨再生明顯加速，EPC-Exos組的血管密度高于對照組。EPC在血管生成中的作用眾所周知，EPC-Exos具有源自EPC的促血管生成特性[35]。Jian等[34]進(jìn)行Microfil灌注和CD31的免疫化學(xué)結(jié)果顯示，EPC-Exos組的牽張再生血管明顯增多。同時，該研究還進(jìn)行了CCK-8測定、傷口愈合測定和管形成測定，以確認(rèn)EPC-Exos對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的促血管生成作用。這些測定表明，EPC-Exos顯著增加了HUVECs的增殖、遷移和血管生成能力。體內(nèi)和體外結(jié)果共同支持了EPC-Exos在DO期間有效刺激血管生成的發(fā)現(xiàn)。由于血管生成對于DO期間的骨再生至關(guān)重要，并且與骨再生相結(jié)合，該研究進(jìn)一步探討了EPC-Exos促進(jìn)血管生成的潛在機制。根據(jù)之前的研究，miR-126主要富集在EPC-Exos中，對EPC-Exos的功能至關(guān)重要，EPC-Exos的促血管生成作用依賴于miR-126；miR-126靶向SPRED-1，后者通過阻斷Raf激活來抑制Ras/ERK信號傳導(dǎo)[35-37]。以上研究表明，EPC-Exos促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合中的血管生成，并加速血管損傷后的再內(nèi)皮化。

3.2.2 VEGF

TTT技術(shù)可以刺激血管生成因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)新生血管生成、VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的高表達(dá)[38]。歐栓機等[39]回顧分析10例糖尿病足患者的臨床資料，在指定時間抽取外周靜血，ELISA法檢測VEGF、bFGF、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、血管衍生生長因子（plateletderived growth factor,PDGF）水平，患者血清VEGF、bFGF、PDGF及EGF表達(dá)水平均在術(shù)后顯著高于術(shù)前，在調(diào)整骨塊過程中，VEGF能調(diào)整自身代謝影響血運重建。bFGF、EGF、PDGF通過旁分泌來促進(jìn)VEGF表達(dá)[40]。當(dāng)細(xì)胞氧傳感機制檢測到缺氧時，血管生成過程就會啟動，從而激活促血管生成分子產(chǎn)生的途徑。傷口中最重要的促血管生成介質(zhì)是VEGF-A，約占愈合皮膚中促血管生成刺激的50%。

VEGF-A的合成位于已充分描述的缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor, HIF-1α）氧感應(yīng)通路的下游[41]。HIF-1是一種二聚體，包含一個α（HIF-1α）和一個β（HIF-1β），HIF-1β也稱為芳烴受體核轉(zhuǎn)位子（aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation factor, ARNT）亞基。通過結(jié)合兩個亞基，HIF-1可以調(diào)節(jié)許多控制缺氧反應(yīng)的基因。在常氧條件下，HIF-1β亞基持續(xù)表達(dá)，而HIF-1α快速降解。然而，在缺氧條件下，HIF-1α?xí)€(wěn)定下來，與HIF-1β結(jié)合，產(chǎn)生的HIF-1分子會激活缺氧反應(yīng)（包括VEGF-A的產(chǎn)生）。VEGF-A雖然是傷口中主要的促血管生成因子，但大量其他促血管生成因子已被證明在傷口愈合中發(fā)揮作用，并有助于整體促血管生成環(huán)境。已被證明可補充傷口中VEGF-A促血管生成活性的因子包括FGF-2、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）、心臟錨蛋白重復(fù)蛋白（cardiac anchor protein repeat protein, CARP）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor, IGF-1）、幾種CXC基序趨化因子（例如CXCL8）和許多其他趨化因子[42]，需要進(jìn)一步明確各細(xì)胞因子在血運重建中具體機制，為臨床實踐提供理論依據(jù)。

3.3 重建巨噬細(xì)胞極化平衡

糖尿病患者傷口表現(xiàn)出失調(diào)和持續(xù)的M1（促炎）巨噬細(xì)胞極化，而正常傷口將在受傷后第3天左右表現(xiàn)出向M2（促愈合）巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。在DFU創(chuàng)面上，巨噬細(xì)胞趨向于M1型極化，而M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量和比例增多導(dǎo)致創(chuàng)面愈合困難[43]，Yang等[44]采用自行設(shè)計的外固定器建立了新型TTT大鼠模型，并研究其對傷口愈合的影響，使用激光散斑灌注成像、血管灌注、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)評估傷口愈合過程。根據(jù)激光散斑成像，TTT組傷口區(qū)域的血流量高于其他組，且觀察到更多的血管，CD31和α-平滑肌肌動蛋白雙重免疫標(biāo)記的TTT組中新血管形成增強，TTT組傷口部位的M2巨噬細(xì)胞數(shù)量也有所增加，TTT技術(shù)治療后還觀察到免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。M1和M2巨噬細(xì)胞在組織修復(fù)的炎癥和增殖階段非常重要[45]。皮膚損傷后的3～5 d是愈合的止血和炎癥階段，此時M1巨噬細(xì)胞是最突出的細(xì)胞，首先被招募來清理傷口內(nèi)的衰老細(xì)胞和碎片[46]。在研究的前9 d，TTT組與對照組傷口閉合與血流量恢復(fù)無顯著差異，表明TTT技術(shù)可能主要通過誘導(dǎo)創(chuàng)面遠(yuǎn)期的血管生成進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面恢復(fù)。例如，在皮膚傷口愈合的增殖階段，TTT技術(shù)顯著促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞恢復(fù)為M2巨噬細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞按表面標(biāo)記分為M2a、M2b、M2c和M2d亞類，具有不同的分泌細(xì)胞因子和生物學(xué)功能。特別是，M2d巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-10和VEGF，這可能將傷口愈合過程中的免疫調(diào)節(jié)功能和血管生成聯(lián)系起來[47-48]。該結(jié)果表明，TTT技術(shù)能降低M1/M2比值，重建巨噬細(xì)胞極化平衡以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

綜上所述，在糖尿病足等下肢缺血性疾病患者中，TTT技術(shù)可有效增加下肢毛細(xì)血管網(wǎng)，改善血液流動，恢復(fù)肢體血供。其血管生成機制考慮為：分泌促血管生成相關(guān)因子，誘導(dǎo)新血管形成；重建巨噬細(xì)胞極化平衡，以M2型為主，加速血管再生；激活相關(guān)細(xì)胞因子通路，促進(jìn)BMSCs向血管生成-成骨耦合等。但仍需進(jìn)一步研究以提供更大樣本的科學(xué)數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究血運重建的分子機制，優(yōu)化手術(shù)流程提供理論依據(jù)。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突