羊乳酪蛋白酶解物的改善睡眠作用

朱秋軼，劉果，龍明芳，劉星雨，喬子驕，宋玉，曾志安，殷光玲，曹素芳，曹庸

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）（2.華南農業(yè)大學財務處，廣東廣州510642）（3.湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州 510663）（4.澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司，湖南長沙 410200）

人類一生中大約有三分之一的時間處于睡眠狀態(tài)[1]，睡眠質量與身心健康密切相關。在現(xiàn)代的快節(jié)奏生活中，慢性壓力[2]、焦慮[3]、抑郁[4]、輪班工作[5]和營養(yǎng)不良[6]等環(huán)境因素嚴重影響睡眠質量，睡眠障礙會導致各種健康問題，包括肥胖[7]、糖尿病[8]和高血壓[9]等疾病。

我國超3億人存在睡眠障礙[10]，使用安眠藥和鎮(zhèn)靜抗抑郁藥對慢性失眠進行藥物治療已被廣泛采用，但是長期使用這些合成藥物常常伴隨耐受性、依賴性等不可忽視的副作用，包括睡眠質量較差、覺醒次數增多、快速眼動睡眠受損或受到抑制等[11]。因此，挖掘副作用小或無副作用的新型助眠物質成為近年來的研究熱點和難點。

生物活性肽是從蛋白質衍生的片段，在人體中發(fā)揮多種生理功能。乳蛋白中包含豐富的生物活性肽，已經從乳蛋白中分離出了具有促睡眠作用的活性肽[12-15]。Dela等[12]研究發(fā)現(xiàn)牛乳酪蛋白酶解物（150 mg/kg）能夠延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠，同時大鼠腦電波記錄結果表明，牛乳酪蛋白酶解物（150 mg/kg）顯著增強大鼠的慢波睡眠時長。Yayeh等[14]使用腦電波信號監(jiān)控大鼠睡眠期間的清醒、非快速眼動睡眠和快速眼動睡眠狀態(tài)，結果表明，牛乳酪蛋白酶解物（300 mg/kg）顯著延長大鼠的睡眠時長并減少睡眠-覺醒周期次數。Kim等[15]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)牛乳酪蛋白酶解物可以改善睡眠質量并且具有良好的耐受性，長期給藥可能會產生累積的促睡眠效果。

隨著人們對羊乳質量和營養(yǎng)認知度的不斷提高，羊乳產品越來越流行。市場上的羊乳產品主要有鮮羊乳、羊奶粉、酸羊乳和羊奶酪等，但是羊乳資源的深度開發(fā)不足。因此，對羊乳蛋白進行酶解，挖掘對人體健康有益的生物活性肽符合現(xiàn)階段羊乳制品深加工的需求。據報道，羊乳蛋白的酶解過程可以產生具有抗高血壓、抗氧化、降糖、抗炎、抗菌、阿片類或免疫調節(jié)活性的多肽[16-20]，但羊乳酪蛋白及其酶解產物的促睡眠活性卻鮮有研究。本實驗對GMCH改善小鼠睡眠的功能進行研究，并初步探究其改善睡眠的作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6～8周BALB/c近交性小鼠，雄性，體質量均為18～22 g，由廣東斯嘉景達生物科技有限公司提供，生產許可證號：SCXK（粵）2020-0052，環(huán)境溫度25～30 ℃，濕度35%～50%，實驗方案經華南農業(yè)大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 材料與設備

羊乳酪蛋白，澳優(yōu)乳業(yè)有限公司；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉，美國Sigma公司；5-HT、GABA、NA和DA檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；地西泮，山東信宜制藥有限公司。

EnSpire酶標儀，美國PerkinElmer公司；萬分之一天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Supermaze動物行為學分析軟件，上海欣軟信息科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GMCH的制備

稱取適量酪蛋白置于燒杯中，以料液比1:10加入超純水，胰蛋白酶添加量為0.4%（m/m），酶解2.5 h，使用2 mol/L的NaOH溶液調節(jié)酶解液pH，酶解過程中pH值維持在8.0，酶解溫度控制為40 ℃。酶解完成后，加熱至95 ℃，維持10 min以使胰蛋白酶失活。隨后冷卻到室溫，4000 r/min離心10 min，取上清液凍干，得到GMCH干粉。

1.3.2 動物分組及處理

將200只小鼠分四批進行實驗，每批50只，隨機分為5組，分別為空白組、GMCH低劑量組、GMCH中劑量組、GMCH高劑量組和地西泮陽性組，每組10只。GMCH低、中、高劑量組的給藥劑量分別為100、400、700 mg/kg，地西泮陽性組的給藥劑量為3 mg/kg，灌胃容量均為0.2 mL/20 g，空白組灌胃同等體積蒸餾水，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃4周。

1.3.3 直接睡眠實驗

末次給藥1 h后觀察小鼠是否進入睡眠狀態(tài)，睡眠狀態(tài)的判斷取決于翻正反射是否消失。將小鼠于背臥位放置60 s，期間動物如果沒有翻轉則判定翻正反射消失，翻正反射消失至恢復期間認為動物處于睡眠狀態(tài)[21]。

1.3.4 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

參考文獻[22]的方法并略作改動，通過預實驗確定戊巴比妥鈉的給藥劑量為40 mg/kg，在各組小鼠末次給藥1 h后腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為0.2 mL。記錄各組小鼠睡眠時間，觀察不同受試樣品對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響。

1.3.5 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

參考文獻[22]的方法并略作改動，通過預實驗確定戊巴比妥鈉的給藥劑量為25 mg/kg。在各組小鼠末次給藥1 h后腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量，注射量為0.2 mL，認為翻正反射消失1 min以上的動物進入睡眠狀態(tài)，記錄動物注射完成后在30 min內的入睡只數。

1.3.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

參考文獻[22]的方法并略作改動，通過預實驗確定巴比妥鈉的給藥劑量為250 mg/kg。在各組小鼠末次給藥1 h后腹腔注射巴比妥鈉，注射量為0.2 mL，注射完成至翻正反射消失期間為入睡潛伏期，記錄各組小鼠入睡潛伏期，觀察不同受試樣品對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.3.7 曠場實驗

參考文獻[23,24]的方法并略作改動，整個曠場實驗需要在安靜的環(huán)境下進行，曠場反應箱高50 cm，底邊長50 cm，底部中心區(qū)域為25 cm×25 cm，其余部分為邊緣區(qū)域。實驗人員每次操作需保持一致，由固定角度將小鼠沿壁放入箱內適應1 min后，開始進行攝像和計時。通過攝像頭記錄小鼠活動情況，每只小鼠測試5 min并記錄其運動軌跡，曠場實驗完成后，清潔曠場箱，避免曠場箱內壁及底面留下氣味及排泄物等。記錄小鼠運動總路程、靜止總時間，平均運動速度、中央停留次數。

1.3.8 下丘腦神經遞質的含量測定

參考文獻[25]的方法并略作改動，實驗小鼠測試觀察完畢后，使用CO2麻醉，心臟取血后冰浴開顱取出大腦，分離出下丘腦，稱重后放入液氮保存?zhèn)溆?，隨后按照1:9的比例添加生理鹽水，在4 ℃條件下勻漿，勻漿液在3000 r/min，4 ℃條件下冷凍離心15 min，取上清液到2 mL離心管中。放于-80 ℃冰箱備用。分別取下丘腦上清液按照試劑盒操作說明測定5-HT、GABA、DA和NE的含量。

1.4 數據分析

所有實驗均至少重復三次，實驗結果以平均數±標準差（mean±SD）表示，通過SPSS 25.0軟件采用單因素方差分析法進行顯著性分析，P＜0.05為顯著差異。

2 結果與討論

2.1 GMCH對小鼠體質量與臟器系數的影響

動物體內各個臟器質量與動物體質量的比值為臟器系數，在正常情況下臟器系數一般不會有明顯差異。由下表可知，相較與空白對照組，陽性對照組和GMCH低、中、高劑量組小鼠的體質量與臟器系數均無顯著差異，表明低、中、高劑量GMCH并未對小鼠產生器質性的影響。

表1 小鼠體質量與臟器系數表Table 1 Body weight and organ coefficient of mice

2.2 GMCH改善小鼠睡眠的試驗評價

2.2.1 GMCH對小鼠直接睡眠的影響

各組小鼠在給予相應的受試樣品后，1 h內均未發(fā)生翻正反射消失的現(xiàn)象，說明GMCH對小鼠無直接睡眠作用。

2.2.2 GMCH對小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時長的影響

通過戊巴比妥鈉睡眠實驗驗證GMCH具有改善睡眠的作用。戊巴比妥鈉和巴比妥鈉是已知的GABAA受體激動劑，當GABA或GABAA受體激動劑與GABAA受體結合時，CI-離子通道打開，導致細胞超極化，細胞興奮性降低，睡眠發(fā)生[26]。具有促進睡眠作用的受試物可以延長巴比妥類藥物引起的睡眠時間[27]。由表2可知，GMCH可以顯著延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時長。與空白組相比，陽性組睡眠時間延長71.02%（P＜0.05），GMCH低、中、高劑量組小鼠睡眠時間分別延長34.46%、48.83%（P＜0.05）、63.19%（P＜0.05），隨著給藥劑量的提升，小鼠的睡眠時間也在延長。說明GMCH與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用，可以顯著（P＜0.05）延長小鼠睡眠時間。Dela等[12]發(fā)現(xiàn)150 mg/kg和300 mg/kg的牛乳酪蛋白酶解物可以顯著延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時長。

表2 GMCH對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時長的影響Table 2 Effects of goat milk casein hydrolysates on sleep duration of sodium pentobarbital in mice

2.2.3 GMCH對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

由表3可知，空白組小鼠注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量后的入睡率為10%，陽性組小鼠入睡率較空白組提升70.00%，GMCH低、中、高劑量組的小鼠入睡率較空白組分別提升20.00%、60.00%、80.00%，樣品組小鼠入睡率隨著GMCH劑量的提升而增加。Qian等[28]的研究表明，與對照組（58.33%）相比，酪蛋白酶解物組（100 mg/kg，66.67%）、十肽組（2 mg/kg，75.00%）和陽性組（1 mg/kg，91.67%）的睡眠率均有所提高。

表3 GMCH對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量入睡率的影響Table 3 Effect of goat milk casein hydrolysates on sleep rate of mice with sodium pentobarbital subthreshold dose

2.2.4 GMCH對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

由表4可知，與空白組相比，陽性組入睡潛伏期縮短140.74%（P＜0.05），低劑量組入睡潛伏期縮短42.86%（P＜0.05），中劑量組入睡潛伏期縮短56.63%（P＜0.05），高劑量組入睡潛伏期縮短91.18%（P＜0.05），隨著GMCH劑量的提升小鼠的睡眠潛伏期也在縮短。結果表明，GMCH與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用，可以顯著縮短小鼠的睡眠潛伏期。結合2.2.1～2.2.3節(jié)的結果，說明GMCH具有改善小鼠睡眠的作用。黃遠英等[29]經口灌胃給予小鼠不同濃度酪蛋白水解物與γ-氨基丁酸復配劑后，200、600 mg/kg劑量組較空白組睡眠時長顯著延長12.23%、10.08%，入睡潛伏期顯著縮短7.50%、6.32%，受試物無直接睡眠作用。Chen等[30]使用核桃肽和γ-氨基丁酸組合治療小鼠30 d，結果顯示，小鼠睡眠時長呈劑量依賴性增加，分別增加21.74%，20.23%和28.10%，中、高劑量組小鼠入睡率顯著增加，入睡潛伏期顯著減少。

表4 GMCH對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Table 4 Effect of goat milk casein hydrolysates on sleep latency of sodium barbitone in mice

2.3 GMCH對小鼠行為學的影響

2.3.1 GMCH對小鼠運動軌跡的影響

為了判斷GMCH對小鼠是否有鎮(zhèn)靜作用，設置曠場實驗觀察小鼠行為學變化。由圖1可知，與陽性組和GMCH樣品組相比，空白組小鼠在曠場中的活動區(qū)域主要分布在邊緣且運動軌跡更為密集，這表明GMCH和陽性藥物能夠減輕小鼠在曠場中的焦慮感。

圖1 小鼠運動軌跡圖Fig.1 Mouse motion track

2.3.2 GMCH對小鼠曠場指標的影響

曠場實驗用于測試動物的自發(fā)活動和探索行為，中央區(qū)停留時間以及進入中央區(qū)的次數可作為評價動物焦慮狀態(tài)的指標[31,32]，動物在曠場中的活動越少表明藥物的鎮(zhèn)靜作用越強[12]。由表5可知，空白組小鼠在曠場中的中央停留次數、平均運動速度、靜止總時間、運動總路程分別為5.80、31.88 mm/s、87.41 s、9560.30 cm，與空白組相比，GMCH低、中、高劑量組小鼠在曠場中的運動總路程有所減少，中央停留時間、中央停留次數和靜止總時間均增多，但無顯著差異，陽性組小鼠在曠場中的中央停留時間、中央停留次數和靜止總時間與空白組相比有顯著增多（P＜0.05），以上指標在一定的程度上反映了GMCH有改善小鼠在曠場中的焦慮狀況的趨勢。梁曹雯等[23]的研究表明，酸棗仁百合睡眠肽復合物處理后，大鼠在中央停留次數、中央區(qū)停留時間、總靜止時間增加，運動總路程減少，但無顯著性差異。Dela等[12]分別以75、150、300、500 mg/kg的牛乳酪蛋白酶解物灌胃小鼠，與空白組相比，小鼠的運動總路程有減少的趨勢，但沒有顯著性差異。

表5 GMCH對小鼠曠場運動的影響Table 5 Effect of goat milk casein hydrolysates on open field movement in mice

2.4 GMCH對小鼠下丘腦中神經遞質含量的影響

為了初步探討GMCH改善睡眠的作用機制，本實驗采用ELISA法測定了小鼠下丘腦中的5-HT、DA、GABA、NE的含量。由表6可知，空白組小鼠下丘腦中GABA、5-HT、DA和NE的含量分別為78.60、158.40、659.40、129.20 ng/g。與空白組相比，GMCH低、中、高劑量組均能明顯升高小鼠腦內GABA和5-HT含量（P＜0.05），GABA含量分別增加64.72%、41.16%、56.19%，5-HT分別增加25.87%、33.50%、43.67%。隨著GMCH劑量的提升，小鼠下丘腦中GABA和5-HT的含量也在增加，但次于陽性組；GMCH低、中、高劑量組小鼠下丘腦中DA和NE的含量較空白組顯著降低（P＜0.05），DA含量分別降低7.02%、12.85%、13.72%，NE含量分別降低18.73%、23.37%、29.41%，低、中、高劑量GMCH對小鼠下丘腦中DA和NE的降低作用與給藥劑量呈負相關。這些結果在相關文獻中有類似的報道[23,33-35]。

表6 GMCH對小鼠下丘腦5-HT、GABA、DA、NE含量的影響(ng/g)Table6 Effects of goat milk casein hydrolysates on the contents of 5-HT, GABA, DA and NE in mouse hypothalamus (ng/g)

下丘腦是調節(jié)睡眠-覺醒模式的中心樞紐，同時分布著喚醒區(qū)域和睡眠區(qū)域。下丘腦中的神經遞質系統(tǒng)已經在實驗動物中進行了廣泛的研究[36]，如5-HT、NE、腺苷、DA、GABA、組胺、下丘腦素等，這些系統(tǒng)在對睡眠障礙治療的應用中有巨大潛力[37,38]。DA能神經元分布在相對較少的小大腦區(qū)域，包括腹側被蓋區(qū)（VTA）、黑質致密部（SNpc）、腹側導水管周圍灰質（VPAG）和一些下丘腦區(qū)域[39]。DA是一種興奮性神經遞質，在調節(jié)運動控制、認知和喚醒方面具有重要作用[40]。GABA是一種非蛋白氨基酸，作為一種主要的抑制性神經遞質存在于哺乳動物大腦中，也是改善睡眠障礙的已知藥物[41]。GABAA受體上的BZD結合位點是大多數鎮(zhèn)靜催眠藥的靶點。5-HT是最早被證明與睡眠-覺醒周期相關的神經遞質之一，有研究表明，5-HT參與睡眠的準備、觸發(fā)和維持[42]。抑制5-HT能神經元的活性會導致失眠，這種失眠可以通過在視前區(qū)注射5-羥色氨酸來逆轉，這表明5-羥色胺在大腦結構中是睡眠所必需的[43]。NE在中樞神經系統(tǒng)中主要由藍斑（Locus Coeruleus，LC）產生，NE能神經元活性在清醒時高，在NREM階段降低，在REM睡眠期間幾乎沉默[44]。NE能神經元在清醒時抑制VLPO區(qū)域（誘導睡眠），而VLPO區(qū)域的抑制解除是睡眠的關鍵前提[45]。本研究的結果表明，GMCH降低了下丘腦中興奮性神經遞質DA、NE的含量，提高了下丘腦中抑制性神經遞質GABA、5-HT的含量。已有的實驗結果顯示，GMCH改善睡眠的作用似乎與調節(jié)中樞神經系統(tǒng)多神經遞質途徑有關，但GMCH是否參與到神經遞質的轉運及與不同類型受體的結合過程，以及在GMCH中起到核心作用的標志性物質還未被篩選出來，這些內容都需要進一步的研究。

3 結論

本課題組對GMCH的生物活性進行了篩選，發(fā)現(xiàn)GMCH具有改善睡眠的作用。在戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗中，地西泮和不同劑量的GMCH均可延長戊巴比妥鈉睡眠時長、提高戊巴比妥鈉閾下劑量入睡率、縮短睡眠潛伏期，其中GMCH的促睡眠功效隨著給藥濃度的增加而增強，在700 mg/kg時達到峰值。觀察不同劑量GMCH對小鼠在曠場中自主活動的影響，結果表明，不同劑量組GMCH減少了小鼠在曠場中的運動總路程同時增多中央停留次數、中央停留時間和靜止總時間，但與空白組相比均無顯著性差異，GMCH在曠場實驗中有抑制動物活動的趨勢，但沒有明確的鎮(zhèn)靜作用。神經遞質測定結果表明，GMCH各劑量能提高小鼠下丘腦中5-HT和GABA的含量同時減少DA 和NE的含量。綜上，GMCH具有較好的改善睡眠作用，其作用途徑可能與其調節(jié)下丘腦中神經遞質水平有關。