糖類化合物碳穩(wěn)定同位素分析技術(shù)及其在土壤碳代謝研究中的應(yīng)用

袁紅朝,賀 珍,張麗萍,耿梅梅,許麗衛(wèi),陳 聞,彭 燦,李春勇,唐思宇,孫德慧,鐘 歡,王久榮

(中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410125)

提升土壤的“碳匯”潛力是目前最有效的減緩大氣CO2濃度升高的途徑之一,也是國家實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的重要舉措。土壤碳代謝是土壤“碳匯”研究的重要內(nèi)容,而土壤糖類化合物為土壤微生物驅(qū)動(dòng)的碳代謝過程提供主要的能源和碳源[1]。因此,科學(xué)地認(rèn)識(shí)土壤糖類化合物及其對(duì)土壤微生物活性的調(diào)節(jié)作用,對(duì)于深入理解土壤有機(jī)質(zhì)礦化和累積過程,進(jìn)一步發(fā)揮土壤“碳匯”功能有著重要意義[2]。

土壤糖類化合物是由碳、氫、氧三種元素組成的有機(jī)物,是多羥基醛酮以及它們的多聚體, 約占土壤碳庫的5%～20%。土壤中的糖類化合物一般分為單糖、低聚糖、多糖及糖類衍生物等[3-4],主要來自動(dòng)植物殘?bào)w、根系分泌物、微生物細(xì)胞以及胞外代謝產(chǎn)物等。土壤中的糖類化合物主要以多糖形式存在,包括氨基糖、纖維素、半纖維素、淀粉和幾丁質(zhì)等。多糖一般難溶于水,也是土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的重要膠合物質(zhì),其中微生物源多糖(主要為氨基糖)與黏粒結(jié)合形成微團(tuán)聚體是土壤團(tuán)聚結(jié)構(gòu)形成的起始步驟[5-7]。多糖在胞外水解酶作用下可分解為低聚糖,進(jìn)一步水解為單糖后被微生物利用,而不同來源的多糖水解后的單糖組分不同。單糖和低聚糖具備快速周轉(zhuǎn)和高度可溶性等特點(diǎn),與微生物活性顯著相關(guān)[8],因此,在前期研究中,土壤糖類化合物含量和特性是土壤“碳匯”研究中的重要指標(biāo)和主要對(duì)象,但是對(duì)于糖類化合物在植物-土壤-微生物系統(tǒng)中代謝過程及其影響因素研究還較少。穩(wěn)定同位素技術(shù)在我國生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用發(fā)展非常迅速,穩(wěn)定碳同位素技術(shù)也成為研究土壤碳循環(huán)最科學(xué)有效的方法之一[9]。土壤糖類化合物作為生物標(biāo)識(shí)物結(jié)合穩(wěn)定碳同位素示蹤技術(shù),可定量研究糖類化合物在植物-土壤-微生物間的流通與轉(zhuǎn)化過程[10-13],為土壤碳代謝及其與微生物活性與功能調(diào)控等方面的研究提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。

采用穩(wěn)定碳同位素示蹤技術(shù)研究土壤碳代謝過程時(shí),準(zhǔn)確定量土壤中糖類化合物的碳同位素豐度非常重要。目前,土壤糖類化合物碳穩(wěn)定同位素分析技術(shù)主要包括有機(jī)質(zhì)譜法(MS)、核磁共振法(NMR)和穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法(IRMS)。IRMS測(cè)定碳同位素比值的精度和準(zhǔn)確性一般比MS高,且IRMS檢測(cè)所需的標(biāo)記量遠(yuǎn)低于MS,能有效降低實(shí)驗(yàn)所需成本[14]。NMR僅能對(duì)糖類化合物大類進(jìn)行分析,不能定性到具體組分[15]。綜合比較,IRMS可以對(duì)糖類化合物進(jìn)行分類定性鑒別,且分析的靈敏度和精度高,性能最優(yōu),已在土壤碳代謝研究中得到廣泛應(yīng)用。然而,土壤中的糖類化合物不能直接進(jìn)行上機(jī)分析,需要進(jìn)行相應(yīng)的前處理轉(zhuǎn)化,如水解提取、分離、組分純化及衍生等(圖1)。而前處理方法是否合適,將會(huì)直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,土壤樣品還存在基質(zhì)復(fù)雜、糖類化合物濃度低和極性高等問題。為此,本研究綜述了目前國內(nèi)外土壤糖類化合物的水解、純化和碳穩(wěn)定同位素分析方法,以及這些分析技術(shù)在土壤碳代謝研究中的應(yīng)用情況,以期推進(jìn)土壤中糖類化合物研究的發(fā)展。

圖1 土壤糖類化合物碳穩(wěn)定同位素分析的流程圖Fig.1 Workflow of soil carbohydrates stable carbon isotope analysis

1 土壤中糖類化合物的前處理

1.1 提取方法

土壤糖類化合物組成復(fù)雜,主要包括單糖、二糖、多糖以及糖類衍生物,其中大多數(shù)以多糖形式存在,但通常均以單糖形式表示,因此分析糖類化合物時(shí),通常需將二糖、多糖及糖類衍生物酸水解為單糖來提取[16-19]。多糖與土壤其他組分之間的聯(lián)結(jié)復(fù)雜,主要相互作用力是氫鍵和共價(jià)鍵,水解的目的是破壞它們之間的鍵合作用,將多糖釋放出來后水解為單糖。多糖酸水解效率受酸種類、濃度、水解時(shí)間、水解溫度以及多糖的鍵合類型等多種因素的影響[20-26]。目前,多糖酸水解提取常用的水解試劑為鹽酸、硫酸和三氟乙酸等,見表1。其中,鹽酸一般用于土壤中氨基糖的水解提取。Zhu等[21]比較了沉積物經(jīng)不同鹽酸水解處理后的定量和成分分析,發(fā)現(xiàn)稀鹽酸(1 mol·L-1)室溫下預(yù)水解2 h,然后梯度升溫至105 ℃保持2 h,最后用濃鹽酸(6 mol· L-1)在105 ℃下繼續(xù)水解8 h的程序最優(yōu)。同一樣品使用該程序水解得到的氨基糖和糖醇類組分的含量均比傳統(tǒng)一步酸水解方法[19]提高了約60%。硫酸一般用來水解纖維素、半纖維素和淀粉等中性糖,采用兩步水解程序,即直接用濃硫酸(12 mol· L-1)浸泡,再用稀硫酸(1.2 mol ·L-1)水解,其中濃硫酸主要水解纖維素形式的多糖,稀硫酸則主要水解非纖維素形式的多糖[24-25]。三氟乙酸則不僅可以水解纖維素、半纖維素、淀粉等中性糖,也可以水解含羧基或硫酸根的多糖,如微生物來源的胞壁酸等。通過對(duì)不同三氟乙酸濃度(如2、4和6 mol·L-1)、不同的水解溫度和時(shí)間的水解效果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)使用4 mol·L-1三氟乙酸在105 ℃下水解4～6 h的組合,土壤中多糖化合物的水解提取效率最高[17,22-23]。

表1 土壤中糖類化合物常用的酸水解提取方法Table 1 Comparison for acid extraction methods of soil carbohydrates

如果僅研究土壤中的單糖類等易溶于水的糖類化合物可以直接采用水提取方法[27-31]。根據(jù)提取溫度分為熱水提取和冷水提取,列于表2。Chantigny等[31]以新西蘭和加拿大東部4種農(nóng)業(yè)土壤為研究對(duì)象,考察了冷水(20 ℃)/熱水(80 ℃)提取和提取時(shí)間(10 min～24 h)對(duì)土壤水溶性有機(jī)物組成的影響,結(jié)果表明,80 ℃提取時(shí)所有組分含量都高于20 ℃提取,而20 ℃下提取的葡萄糖濃度隨著提取時(shí)間的增加而下降。歸其原因可能是:① 在較高溫度下土壤可溶性糖類的溶解性增加;② 高溫抑制了微生物對(duì)土壤單糖的利用,因此延長提取時(shí)間會(huì)提高提取效率,而常溫下則相反,單糖含量隨著提取時(shí)間的增加而下降。Ghani等[27]也發(fā)現(xiàn)使用80 ℃熱水提取16 h得到的糖類化合物的比例可達(dá)到40%以上。

表2 土壤中糖類化合物常用的水提取方法Table 2 Comparison for water extraction methods of soil carbohydrates

1.2 分離純化方法

水提取的樣品純化步驟比較簡單,僅需要先通過0.45μm硝酸纖維素膜過濾除雜,濾液再根據(jù)分析目標(biāo)物選擇合適的純化小柱分離純化后即可用于后續(xù)分析。

2 土壤糖類化合物碳穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析技術(shù)

目前土壤中糖類化合物的碳穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析方法主要有:元素分析儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法(EA-IRMS)[32]、總有機(jī)碳分析儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法(TOC-IRMS)[33]、液相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法(LC-C-IRMS)[34-35]、熱裂解氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法(Py-GC-C-IRMS)[36-37]、氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法(GC-C-IRMS)[38-40]等5種,可大致歸為以下兩大類。

2.1 總糖碳穩(wěn)定同位素分析方法

EA-IRMS和TOC-IRMS方法適合不需要確定到特定糖種類的土壤糖類化合物碳同位素研究。由于其不具備組分分離定性能力,因此僅能對(duì)提取純化后的土壤總糖進(jìn)行碳穩(wěn)定同位素分析。該方法需要的樣品量較多(樣品中需要含有5 μg C以上),測(cè)定結(jié)果易受共提取的其他可溶性碳,如酚類、氨基酸和有機(jī)酸等的干擾[32-33]。

2.2 單體糖碳穩(wěn)定同位素分析方法

當(dāng)涉及單體糖類組分的穩(wěn)定同位素分析時(shí),則需要利用色譜分離技術(shù)結(jié)合穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀,如Py-GC-C-IRMS,LC-C-IRMS或GC-C-IRMS等,對(duì)提取土壤糖的單體糖組分進(jìn)行定性、定量及碳同位素豐度分析[34-41],列于表3。

表3 土壤中單體糖的碳穩(wěn)定同位素分析方法Table 3 Comparison of soil carbohydrates compound-specific stable-C-isotope analysis

其中,Py-GC-C-IRMS的檢測(cè)目標(biāo)物為裂解物,可根據(jù)已有文獻(xiàn)將裂解產(chǎn)物對(duì)原化合物組分進(jìn)行有效歸類(如碳水化合物、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)),具備樣品制備快速,無需衍生化以及良好的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。但存在低熱解產(chǎn)率或色譜分離不足等問題對(duì)檢測(cè)造成干擾,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

GC-C-IRMS是目前糖類化合物碳穩(wěn)定同位素分析最常用的技術(shù),然而,糖類化合物需要衍生化后才能進(jìn)行檢測(cè)分析[12]。衍生方法常見的不足包括衍生處理耗時(shí)長、衍生試劑不穩(wěn)定以及異構(gòu)體導(dǎo)致的復(fù)雜色譜峰型等,而且衍生化試劑中碳原子的加入,導(dǎo)致化合物中的13C/12C比值發(fā)生變化,結(jié)果還需要進(jìn)行校正[12]。常用的三種衍生方法為三甲基硅基化[38-39]、乙醛糖醇衍生法[40,45-46]和甲基硼[47],列于表4。其中,三甲基硅烷化法在對(duì)單糖類化合物阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖等進(jìn)行13C分析時(shí)會(huì)出現(xiàn)多個(gè)異構(gòu)體峰,引入的外源碳也需要進(jìn)行校正。乙醛糖醇衍生法可用于對(duì)單糖物質(zhì),如鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、巖藻糖、核糖等分析,方法的分析精度可達(dá)0.3‰,在衍生過程中碳鍵的斷裂引起的分餾可以進(jìn)行校正,且引入的外源碳量最少。但衍生產(chǎn)物隨機(jī)性大,后續(xù)對(duì)結(jié)果的校正相對(duì)繁瑣。甲基硼衍生方法可用于對(duì)單糖類,如阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、果糖和葡萄糖進(jìn)行分析,方法快速簡便,且在衍生過程中不涉及同位素分餾,得到的13C值更精確,但過量甲基硼的去除操作較為復(fù)雜。優(yōu)化甲基硼衍生測(cè)定土壤中單糖的方法,并對(duì)其精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià),是今后的一個(gè)研究方向。

表4 土壤中糖GC-C-IRMS測(cè)定的衍生方法比較Table 4 Comparison for GC-C-IRMS derivation methods of soil sugar stable-C-isotope analysis

綜上所述,由于土壤糖類化合物成分復(fù)雜、各類型間差異大,因此在開展相關(guān)研究時(shí),需要根據(jù)樣品類型和成分差異,結(jié)合研究目的和精度要求,選擇合適的糖類化合物碳穩(wěn)定同位素分析前處理和分析方法,盡量避免同位素分餾,從而獲得準(zhǔn)確可靠的研究結(jié)果。

3 糖類化合物碳穩(wěn)定同位素技術(shù)在土壤碳代謝研究中的應(yīng)用

糖類化合物的碳穩(wěn)定同位素技術(shù)通常用于追蹤土壤碳代謝中糖類化合物的來源,或量化土壤中糖類化合物的碳代謝過程等。如通過量化土壤中(半乳糖+甘露糖)與(阿拉伯糖+木糖)的比例,分析土壤中糖的初級(jí)(植物來源)和次級(jí)(微生物來源和SOM來源)來源。Ekberg等[36]通過Py-GC/MS-C-IRMS分析了土壤可溶性糖類化合物的組成和碳穩(wěn)定同位素值,根據(jù)熱解產(chǎn)物性質(zhì)進(jìn)行分組獲得的主要前體來源為多糖、蛋白質(zhì)或混合來源(主要是木質(zhì)素和蛋白質(zhì)的衍生物)。且隨著作物生長季的推進(jìn),三組前體的碳穩(wěn)定同位素值都有所增加,表明隨著外源有機(jī)物快速被微生物利用周轉(zhuǎn)不斷向土壤碳庫輸入。Derrien等[39]通過13CO2脈沖標(biāo)記結(jié)合GC-C-IRMS分析技術(shù),追蹤了碳在植物-土壤系統(tǒng)流通,以揭示植物根際沉積碳特別是糖類化合物的性質(zhì)和動(dòng)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),以聚合物的形式存在的葡萄糖是根際沉積碳的主要部分,40%的根際碳以中性糖的形式存在,并且微生物來源糖表現(xiàn)出隨時(shí)間增加,根際糖迅速趨于穩(wěn)定向土壤有機(jī)質(zhì)方向積累的特征。

此外,糖類化合物是土壤物質(zhì)代謝的主要能源、碳源和驅(qū)動(dòng)力,其變化規(guī)律可指示土壤有機(jī)碳庫的總體變化[48]。其中,土壤可溶性糖是土壤有機(jī)碳源中最活躍的碳源,維持和刺激根際和碎屑層中的微生物活動(dòng),從而調(diào)控土壤有機(jī)質(zhì)分解和激發(fā)效應(yīng)來推動(dòng)土壤養(yǎng)分循環(huán)過程[49]。應(yīng)用糖類化合物的碳穩(wěn)定同位素技術(shù)量化糖礦化的初始速率、平均滯留時(shí)間(MRT)、進(jìn)入到微生物生物量的MRT以及進(jìn)入到土壤有機(jī)質(zhì)的MRT等,可以評(píng)估糖在土壤剖面的遷移、植物和微生物吸收與利用效率等。Fischer等[50]選取了代表性可溶性糖(葡萄糖)研究其在不同濃度范圍內(nèi)被土壤固定和微生物利用的速率,發(fā)現(xiàn)葡萄糖的轉(zhuǎn)化速度非?？?大部分在30 min內(nèi)完成了周轉(zhuǎn)。在較低濃度范圍時(shí)(<100 μmol/L)糖類碳大部分被利用到微生物生物量中,但當(dāng)濃度增加時(shí),糖類碳開始傾向于礦化為CO2。該研究指出,可溶性糖類的礦化速率主要受微生物吸收和利用控制,物理過程如吸附的貢獻(xiàn)較少,并且利用的偏好主要取決于其濃度。Qiu等[51]通過比較水稻土和旱地土壤之間可溶性糖類化合物的代謝差異,發(fā)現(xiàn)水稻土中礦化作用和激發(fā)效應(yīng)普遍弱于旱地土壤,揭示了水稻土具有較高土壤有機(jī)質(zhì)儲(chǔ)量的內(nèi)在機(jī)制(如礦化緩慢、負(fù)激發(fā)效應(yīng))。

4 問題與展望

隨著糖類化合物的碳穩(wěn)定同位素分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用,對(duì)土壤中糖類化合物的來源、轉(zhuǎn)化過程和累積規(guī)律等的理解也在不斷加深。但仍存在許多不足,有待進(jìn)一步研究。

4.1 前處理

目前的土壤糖類化合物水解提取方法各有偏好,還沒有一種方法能將土壤中糖類化合物全部水解出來,如果能同時(shí)水解出更多糖類物質(zhì),將會(huì)提高糖類化合物研究的整體性,這將是今后土壤糖類化合物水解研究的一個(gè)發(fā)展方向。此外,土壤糖類化合物的前處理過程多涉及復(fù)雜的水解、純化及衍生等步驟,大部分由人工操作完成,需要較高的人力和時(shí)間成本,并且對(duì)操作人員的熟練程度有較高要求,在未來需要研究開發(fā)自動(dòng)化前處理設(shè)備,實(shí)現(xiàn)前處理流程的自動(dòng)化操作,以減少人為操作的干擾,不僅可以提高分析效率,也能增加研究結(jié)果的可靠性。

4.2 分析技術(shù)

目前糖類化合物的碳同位素分析方法多集中在氨基糖、中性單糖類,對(duì)單糖的聚合物和糖類衍生物等的分析技術(shù)還比較少,有待進(jìn)一步研究探索。

4.3 應(yīng)用研究

利用碳穩(wěn)定同位素標(biāo)記,研究外源糖類化合物進(jìn)入土壤后在各粒級(jí)團(tuán)聚體中的累積規(guī)律,評(píng)價(jià)糖類化合物在團(tuán)聚體形成中的作用;同時(shí)結(jié)合核酸探針(DNA-SIP)技術(shù),解析糖類化合物在土壤不同粒徑中周轉(zhuǎn)的微生物過程,評(píng)估其對(duì)SOM形成和碳固定的貢獻(xiàn)。在以上研究的基礎(chǔ)上,再進(jìn)一步探索不同土壤利用措施下,外源糖類化合物在土壤中轉(zhuǎn)化與累積的差異,開發(fā)有利于外源糖類化合物在土壤中積聚的有效技術(shù)和途徑,以期提升土壤“碳匯”潛力,助力國家“雙碳目標(biāo)”的實(shí)現(xiàn)。這些都將會(huì)是未來研究的熱點(diǎn)方向。