锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液中放化純度薄層色譜分析方法的建立

王 勇,梁 塑,崔曉艷,姜 華,張 云,楊 柳

(原子高科股份有限公司,北京 102413)

锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液(以下簡稱99mTc-MDP注射液)是較理想的骨顯像劑,用于早期診斷惡性轉(zhuǎn)移性骨腫瘤和原發(fā)性骨腫瘤,對移植骨的存活監(jiān)測、診斷外傷性骨折、骨骼炎癥和代謝性骨病等均有重要價值[1-3]。放化純度是99mTc-MDP注射液的有效性控制指標(biāo)之一[4],其高低決定了臨床診斷效果。影響放化純度的主要因素是放射性化學(xué)雜質(zhì)的含量。注射用亞錫亞甲基二膦酸鹽(以下簡稱MDP藥盒)的一般組成為亞甲基二膦酸、還原劑(氯化亞錫/氟化亞錫等)、抗氧化劑(維生素C等)和pH調(diào)節(jié)劑等。MDP藥盒的99mTc標(biāo)記原理為:高锝[99mTc]酸鹽被還原劑由Ⅶ價態(tài)還原到Ⅳ價態(tài)[5],與過量的亞甲基二膦酸發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),室溫靜置一定時間,確保絡(luò)合反應(yīng)充分進行。在標(biāo)記過程中,還原劑不足的情況下,高锝[99mTc]酸鹽不能被完全還原,則可能存在的放射性化學(xué)雜質(zhì)為游離高锝[99mTc]酸鹽,可致血液本底增高,并可能在甲狀腺胃黏膜等臟器中濃集;在還原劑足量的情況下,高锝[99mTc]酸鹽被還原,但未完全與亞甲基二膦酸發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),則可能存在還原水解锝[99mTc](以下簡稱膠體锝[99mTc])放射性化學(xué)雜質(zhì),可分布在肝皮部位。另外,劉國正等[6]在1999年報道,在亞錫還原條件下,當(dāng)pH<9時,維生素C與高锝[99mTc]酸鹽可能會形成五價配合物。放射性化學(xué)雜質(zhì)的存在影響著藥物的體內(nèi)分布和代謝,為了保證藥物診斷的有效性以及患者用藥的安全性,須嚴格對其放射性化學(xué)雜質(zhì)高锝[99mTc]酸鹽、膠體锝[99mTc]、可能存在的锝[99mTc]維生素C絡(luò)合物進行控制[7-8]。因此,擬建立的放化純度分析方法應(yīng)具有較好的專屬性,能實現(xiàn)99mTc-MDP注射液中放射性主峰锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽與各放射性化學(xué)雜質(zhì)的有效分離。

對于99mTc-MDP注射液放化純度的控制,《中國藥典》2020年版(ChP2020)、《美國藥典》42-NF37版(USP42-NF37)和《歐洲藥典》10.0版(EP10.0)均采用雙體系的分析方法。EP10.0采用薄層色譜法,iTLC-SG色譜紙作為固定相、1 mol/L的醋酸鈉溶液和2-丁酮分別為體系一和體系二的展開劑。ChP2020和USP42-NF37均采用紙色譜法,氯化鈉注射液(0.90%氯化鈉溶液)和85%甲醇分別為體系一和體系二的展開劑。國內(nèi)外藥典方法均為雙體系的分析方法,并且ChP2020和USP42-NF37中的體系一要求在充氮條件下進行,導(dǎo)致實驗過程耗時且繁瑣。基于此,本研究主要從篩選固定相和展開劑入手,開發(fā)一種專屬性強、操作簡便的分析方法,用于測定99mTc-MDP注射液的放化純度,并開展線性、耐用性、精密度等實驗,對建立的分析方法進行驗證。

1 實驗設(shè)備與材料

1.1 主要儀器

AR-2000放射性薄層掃描儀:美國BIOSCAN公司;XPR205/A電子天平:梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;CRC-55tR活度計:美國CAPINTEC公司。

1.2 主要試劑和耗材

氯化鈉注射液:石家莊四藥有限公司;氯化鈉淋洗液、高锝[99mTc]酸鈉注射液、锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液:原子高科股份有限公司;醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氯化亞錫(SnCl2·2H2O)、甲醇、2-丁酮、維生素C:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;水:自制二次蒸餾水。

聚酰胺-6薄層板:浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠;Whatman No.1層析紙:英國Whatman公司;iTLC-SG色譜紙:美國Agilent公司;硅膠G薄層板:MACHEREY-NAGEL公司。

MDP標(biāo)準(zhǔn)藥盒:波蘭POLATOM公司。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1供試品溶液(99mTc-MDP注射液) 按高锝[99mTc]酸鈉注射液的放射性濃度,取4～6 mL注入MDP藥盒中,充分振搖,使藥盒完全溶解,靜置反應(yīng)5 min以上,即得含锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽的供試品溶液。

2.1.2參考溶液 向一瓶MDP標(biāo)準(zhǔn)藥盒中加入2 mL含100～400 MBq的高锝[99mTc]酸鈉注射液,搖勻,靜置反應(yīng)約15 min,即得含锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽的參考溶液。

2.1.3測試溶液1 取高锝[99mTc]酸鈉注射液適量,作為含高锝[99mTc]酸鹽的測試溶液1。

2.1.4測試溶液2 準(zhǔn)確稱取10 mg的SnCl2·2H2O于西林瓶內(nèi),加入0.1 mL高锝[99mTc]酸鈉注射液,搖勻,靜置反應(yīng)約15 min,即得含膠體锝[99mTc]的測試溶液2。

2.1.5測試溶液3 在10.0 g/L維生素C的10 mL溶液中用微量進樣器加入10.0 g/L SnCl2·2H2O溶液0.010 mL,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH為8.0。取出1 mL,用注射器加入少量高锝[99mTc]酸鈉注射液,充分振搖,靜置反應(yīng)5 min以上,即得含維生素C與高锝[99mTc]酸鹽形成的五價配合物溶液[6]。

2.2 放化純度分析方法的建立

使用玻璃毛細管或微量進樣器取供試品溶液適量,點于固定相一端原點處,晾干,將固定相放入盛有展開劑的層析缸展開,待展開至溶劑前沿10 cm時,將固定相取出,晾干。測試溶液1、測試溶液2按照上述相同的分析方法進行實驗。之后置于放射性薄層掃描儀上掃描,記錄色譜圖,觀察供試品溶液中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽的峰形以及與測試溶液1中高锝[99mTc]酸鹽、測試溶液2中膠體锝[99mTc]之間的分離度R(計算如公式(1))。并根據(jù)锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值選擇合適的條件。

R=2×(d2-d1)/(W1+W2)

(1)

式中:d2為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離,mm;d1為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離,mm;W1和W2為相鄰兩峰各自的峰寬,mm。

2.2.1固定相優(yōu)化

(1) 以ChP2020和USP42-NF37收錄的分析方法中0.90%氯化鈉溶液和85%甲醇分別作為體系一和體系二的展開劑,固定相分別為聚酰胺-6薄層板、Whatman No.1色層紙、硅膠G板和iTLC-SG色譜紙?？疾觳煌瑮l件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

(2) 以EP10.0收錄的分析方法中1 mol/L醋酸鈉溶液和2-丁酮分別作為體系一和體系二的展開劑,固定相分別為聚酰胺-6薄層板、Whatman No.1色層紙、硅膠G板和iTLC-SG色譜紙?？疾觳煌瑮l件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

2.2.2展開劑優(yōu)化 ChP2020、USP42-NF37和EP10.0收錄的分析方法中體系二展開劑為85%甲醇或2-丁酮,對放射性雜質(zhì)高锝[99mTc]酸鹽的分離效果幾乎無差別。故對于展開劑的優(yōu)化實驗主要針對體系一(即水相)進行,分別以0.90%氯化鈉溶液和1 mol/L醋酸鈉溶液為展開劑初設(shè)條件,以2.2.1節(jié)中最佳固定相為該部分實驗的固定相,設(shè)計以下兩組實驗。

(1) 展開劑分別為0.45%氯化鈉溶液、0.90%氯化鈉溶液、2.00%氯化鈉溶液、0.90%氯化鈉溶液(醋酸調(diào)pH為3.0)、0.90%氯化鈉溶液(醋酸調(diào)pH為10.0),考察不同條件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

(2) 展開劑分別為1 mol/L醋酸鈉溶液、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L醋酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.5 mol/L鹽酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.05 mol/L鹽酸溶液)=1∶1,考察不同條件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

2.2.3分析方法專屬性 供試品溶液、參考溶液、測試溶液1、測試溶液2和測試溶液3按照2.2節(jié)中描述的分析方法進行實驗。之后置于放射性薄層掃描儀上掃描,記錄色譜圖,觀察供試品溶液和參考溶液中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形以及與測試溶液1中高锝[99mTc]酸鹽、測試溶液2中膠體锝[99mTc]、測試溶液3中锝[99mTc]維生素C絡(luò)合物之間的分離度R,供試品溶液與參考溶液的锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰峰形和Rf值應(yīng)一致,供試品溶液的锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰與各放射性化學(xué)雜質(zhì)峰的分離度R應(yīng)大于1.0。

2.3 放化純度分析方法的驗證

按照ChP2020收錄的《9101分析方法驗證指導(dǎo)原則》[9]以及ICH指導(dǎo)原則《Q2(R1):分析方法論證:正文和方法學(xué)》的相關(guān)要求,對擬定分析方法進行線性及范圍、耐用性和精密度等項目的驗證。

2.3.1線性及范圍 取一批次99mTc-MDP注射液作為線性母液,其放射性濃度為21.2 mCi/mL,用微量注射器精密移取一定活度的99mTc-MDP注射液(放射性活度分別為1.06、2.12、5.3、10.6、15.9、21.2、31.8、42.4 μCi)作為線性點點樣于固定相上;然后再精密量取一定量的線性母液,用氯化鈉注射液稀釋至放射性濃度為0.54 mCi/mL,用微量注射器精密移取一定活度的99mTc-MDP注射液(放射性活度分別為0.027、0.054、0.135、0.27、0.405、0.54、0.81、1.08 μCi)作為線性點點樣于固定相上。晾干后,置于放射性薄層掃描儀上,測定并記錄放射性計數(shù)?？疾旆派湫杂嫈?shù)與放射性活度成比例關(guān)系的能力,并確定分析方法的測量范圍。

2.3.2耐用性 分別考察不同批次的固定相、實驗室環(huán)境溫度(10～30 ℃)、不同體積配比展開劑對99mTc-MDP注射液放化純度測定的影響。在以上條件下放化純度測定結(jié)果相對誤差應(yīng)≤2.0%,分析條件的微小改變應(yīng)對99mTc-MDP注射液放化純度測定無明顯影響。

2.3.3中間精密度 兩名實驗人員對同一批次99mTc-MDP注射液進行放化純度分析。供試品溶液展開晾干后置于放射性薄層掃描儀上測定;按照上述方法,每名實驗人員各平行實驗6次,共計12次放化純度測試結(jié)果,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,得到中間精密度,合格限度應(yīng)≤2.0%。

2.3.4分析方法的比對 使用擬定分析方法與EP10.0[10]、ChP2020[11]和USP42-NF37[12]收錄的分析方法對至少三批次99mTc-MDP注射液的放化純度進行比對測定,測定結(jié)果的相對誤差應(yīng)≤2.0%。

3 結(jié)果與討論

3.1 放化純度分析方法的建立

3.1.1固定相優(yōu)化 以0.9%氯化鈉溶液和85%甲醇分別作為展開體系一和體系二的展開劑,對固定相優(yōu)化后的結(jié)果列于表1;以1 mol/L醋酸鈉溶液和2-丁酮分別作為展開體系一和體系二的展開劑,對固定相優(yōu)化后的結(jié)果列于表2。

表2 固定相優(yōu)化實驗分析結(jié)果(2)Table 2 Analysis results in optimized experiment of stationary phases (2)

從表1和表2可以看出,兩組實驗中固定相為iTLC-SG色譜紙、硅膠G薄層板、Whatman No.1色層紙時,展開體系一或體系二存在锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽(簡稱99mTc-MDP)放射性主峰拖尾、放射性主峰與放射性化學(xué)雜質(zhì)峰無法分離或分離效果差等情況;而固定相為聚酰胺-6薄層板,0.90%氯化鈉溶液或1 mol/L醋酸鈉溶液為展開劑時,99mTc-MDP放射性主峰均有拖尾現(xiàn)象,但實現(xiàn)了單體系展開條件下將放射性主峰與各放射性化學(xué)雜質(zhì)峰的有效分離。考慮99mTc-MDP注射液為短半衰期藥物,單體系展開條件可以更快得到放化純度檢驗結(jié)果,更有利于產(chǎn)品的放行檢驗。故確定分析方法為單體系,固定相為聚酰胺-6薄層板。

3.1.2展開劑優(yōu)化 以聚酰胺-6薄層板為固定相,對展開劑進行優(yōu)化的結(jié)果列于表3。從表3的分析結(jié)果可以看出,以0.90%氯化鈉溶液或1 mol/L醋酸鈉溶液為展開劑,均能實現(xiàn)锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰與各放射性化學(xué)雜質(zhì)峰的分離;以0.90%氯化鈉溶液為初設(shè)展開劑進行優(yōu)化,改變氯化鈉的質(zhì)量分數(shù)、使用醋酸調(diào)節(jié)展開劑的酸堿度,對99mTc-MDP注射液中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰拖尾情況的改善程度不明顯;以1 mol/L醋酸鈉溶液為初設(shè)展開劑進行優(yōu)化,其中展開劑為1 mol/L醋酸鈉溶液與0.1 mol/L醋酸溶液等體積混合時,放射性主峰拖尾情況也未得到改善;當(dāng)展開劑為1 mol/L醋酸鈉溶液與不同濃度的鹽酸溶液等體積混合時,放射性主峰拖尾程度變輕,得到了明顯的改善;尤其是鹽酸溶液濃度為0.1 mol/L時,效果最佳,放射性主峰與各放射性化學(xué)雜質(zhì)的分離度>1.0,放射性主峰拖尾程度進一步得到了改善,峰形良好。

表3 展開劑優(yōu)化實驗分析結(jié)果Table 3 Analysis results in optimized experiment of developing solvent

3.1.3分析方法專屬性 通過固定相和展開劑的優(yōu)化篩選實驗,擬定分析方法為:固定相為聚酰胺-6薄層板,展開劑為V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1。使用玻璃毛細管或微量進樣器取供試品溶液適量,點于固定相一端原點處,晾干,將聚酰胺-6薄層板放入盛有V(1 mol/L醋酸鈉溶液):V(0.1 mol/L 鹽酸溶液)=1∶1的溶液的層析缸展開,待展開至溶劑前沿10 cm時,將固定相取出,晾干;參考溶液、測試溶液1、測試溶液2和測試溶液3按照上述相同的分析方法進行實驗。之后置于放射性薄層掃描儀上掃描,各色譜圖示于圖1。圖1a和圖1b可以看出,供試品溶液和參考溶液色譜圖中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰的峰形良好且?guī)缀跻恢?Rf均約為1.0。從圖1c、圖1d和圖1e可以看出,測試溶液1中高锝[99mTc]酸鹽、測試溶液2中膠體锝[99mTc]、測試溶液3中锝[99mTc]維生素C絡(luò)合物的Rf約為0。通過公式(1)計算出供試品溶液的锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰與各放射性化學(xué)雜質(zhì)峰的分離度R均大于1.0,滿足要求。

a——供試品溶液; b——參考溶液; c——測試溶液1; d——測試溶液2; e——測試溶液3

3.2 放化純度分析方法的驗證

3.2.1線性及范圍 放射性計數(shù)與放射性活度的線性關(guān)系示于圖2。由圖2可知,當(dāng)99mTc-MDP注射液的放射性活度在0.027～42.4 μCi范圍內(nèi)時,99mTc-MDP注射液的放射性計數(shù)與放射性活度成線性關(guān)系,線性方程為y=8 791.451 15x+4 579.041 87,相關(guān)系數(shù)r=0.997,滿足r≥0.990的要求。

圖2 放射性計數(shù)與放射性活度的線性關(guān)系Fig.2 The linear relation of the radioactivity counts to the radioactivity

3.2.2耐用性 取不同批次聚酰胺-6薄層板按照擬定分析方法進行實驗,放化純度測定結(jié)果間的相對誤差為0.33%。在不同溫度實驗條件下,10 ℃和30 ℃展開時與室溫25 ℃展開時測定的放化純度結(jié)果的相對誤差分別為0.45%和0.94%。展開劑體積配比為V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L 鹽酸溶液)分別為0.8∶1(V/V)、0.9∶1(V/V)、1.1∶1(V/V)、1.2∶1(V/V)時,測定的放化純度結(jié)果與V(1 mol/L醋酸鈉溶液):V(0.1 mol/L 鹽酸溶液)=1.0∶1的相對誤差分別為0.36%、0.38%、0.53%、1.12%。以上放化純度測定結(jié)果的相對誤差均滿足≤2.0%的要求,說明分析條件的微小改變對99mTc-MDP注射液放化純度測定無明顯影響。

3.2.3中間精密度 兩名實驗人員對同一批次99mTc-MDP注射液進行放化純度分析。每名實驗人員各平行實驗6次,共計12次放化純度測試結(jié)果,所得Rf分別為0.973、0.974、0.974、0.929、0.943、0.966、0.982、0.980、0.981、0.937、0.973和0.973;放化純度分別為97.13%、97.07%、96.64%、95.84%、94.56%、96.69%、97.27%、96.93%、96.58%、96.20%、96.83%和97.35%,平均值為96.60%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.80%(n=12),滿足≤2.0%的要求,表明該方法的中間精密度良好。

3.2.4分析方法比對 使用擬定分析方法與EP10.0[9]、ChP2020[10]和USP42-NF37[11]收錄的分析方法對99mTc-MDP注射液的放化純度進行比對測定,詳細結(jié)果列于表4和表5。從表4可以看出,四批次99mTc-MDP注射液,本方法測定放化純度的平均值為97.03%,《中國藥典》[10]/《美國藥典》[11]測定放化純度的平均值為97.06%,兩種方法測量結(jié)果的相對誤差為0.03%。從表5可以看出,四批次99mTc-MDP注射液,本方法測定放化純度的平均值為98.17%,歐洲藥典測定放化純度的平均值為97.92%,兩種方法測量結(jié)果的相對誤差為0.26%。通過擬定方法與各國藥典方法的比對結(jié)果看,測量結(jié)果的相對誤差均滿足≤2.0%的要求,說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性。

表4 99mTc-MDP注射液的放化純度測量結(jié)果比對(1)Table 4 Comparison of radiochemical purity measurements of 99mTc-MDP injection (1)

表5 99mTc-MDP注射液的放化純度測量結(jié)果比對(2)Table 5 Comparison of radiochemical purity measurements of 99mTc-MDP injection (2)

4 結(jié)論

本研究建立了一種用于99mTc-MDP注射液放化純度檢測的薄層色譜分析方法,即以聚酰胺-6薄層板為固定相,V(1 mol/L醋酸鈉溶液):V(0.1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1為展開劑。并對該分析方法進行了專屬性、線性、耐用性、精密度等方法學(xué)驗證,驗證結(jié)果均符合要求。該分析方法可實現(xiàn)放射性主峰與各放射性化學(xué)雜質(zhì)峰的有效分離,分離度>1.0,并且明顯改善了放射性主峰拖尾的情況,峰形良好。因此,該分析方法可用于99mTc-MDP注射液的放化純度測定。