酸敏感離子通道3對(duì)腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟高敏感性的影響及其機(jī)制

張立霞，閆波，潘穎，田平平，張衛(wèi)潔，李歡，袁麗萍*

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，安徽合肥 230022；2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院兒科，安徽宿州 234000；3安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系，安徽合肥 230026

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是兒童常見的一種慢性反復(fù)發(fā)作的功能性胃腸病，主要特征為腹痛、腹脹、排便習(xí)慣改變及大便性狀異常(腹瀉、便秘、黏液便等)。IBS在兒童時(shí)期發(fā)病率很高，全球約20%的學(xué)齡兒童生活和學(xué)習(xí)情況受到其影響[1]。IBS的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為與飲食、環(huán)境、炎癥、感染、精神等因素導(dǎo)致的“腦-腸軸”互動(dòng)異常以及腸道動(dòng)力、內(nèi)臟敏感性改變有關(guān)[2]。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channel，ASIC)是可被酸激活的通道蛋白，能夠?qū)ρ装Y、疼痛、癲癇等病理反應(yīng)產(chǎn)生響應(yīng)，這些病理反應(yīng)的共同特點(diǎn)是組織酸化，而腸道在多種異常代謝產(chǎn)物的影響下亦可出現(xiàn)腸組織酸化，產(chǎn)生相似的病理反應(yīng)。ASIC被證實(shí)在胃腸道內(nèi)廣泛分布，并可對(duì)胃腸道酸環(huán)境的改變做出反應(yīng)，從而維持胃腸道功能的穩(wěn)定。既往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠接受便秘患兒糞菌移植后其結(jié)腸組織中ASIC3表達(dá)水平明顯升高[3]，但ASIC3在母嬰分離(neonatal maternal separation，NMS)大鼠IBS 內(nèi)臟高敏感性形成中的作用及機(jī)制尚未完全明確。目前的研究顯示，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)通路與腸道動(dòng)力、內(nèi)臟敏感性密切相關(guān)[4-5]。本研究采用NMS法建立IBS大鼠模型，腸道動(dòng)力及5-HT通路的影響，探討ASIC3對(duì)IBS大鼠內(nèi)臟敏感性的影響及5-HT 信號(hào)通路在其中的作用，以期找到IBS 新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 SPF 級(jí)健康SD 孕鼠3 只，孕齡16～20 d，體重260～280 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)條件符合SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，溫度設(shè)置為(22±2) ℃，相對(duì)濕度控制在45%～60%，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，自由飲水、進(jìn)食；待孕鼠分娩幼鼠，每只孕鼠分娩約10 只幼鼠。ASIC3 抑制劑APETx2購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，外徑4 mm硅膠導(dǎo)管、4～6 cm的柔軟乳膠指套購(gòu)自北京澤平科技公司，異氟醚、石蠟、印度墨汁、2%戊巴比妥鈉購(gòu)自福州邁新公司，4%多聚甲醛溶液購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 IBS模型的建立及分組 產(chǎn)后第2天開始，將分娩的6 只幼鼠與母鼠繼續(xù)在原籠中飼養(yǎng)，作為對(duì)照組；其余幼鼠取出分別放入另一籠中飼養(yǎng)，每天將母鼠與幼鼠分離3 h，3 h后將兩組幼鼠分別放回原籠中，直到第21天結(jié)束。第22天所有幼鼠斷奶后單獨(dú)飼養(yǎng)，于自然環(huán)境下飼養(yǎng)至第8 周(即大鼠成年)，體重220～240 g。對(duì)NMS 大鼠采用腹部回撤反射(abdominal withdraw reflex，AWR)評(píng)分來檢測(cè)內(nèi)臟痛反應(yīng)，AWR評(píng)分明顯升高即為造模成功。選取造模成功的16 只大鼠隨機(jī)分為NMS 組(n=8)與NMS+APETx2 組(n=8)。NMS+APETx2 組 每 日 腹 腔 注 射100 μg/kg APETx2，而NMS 組及對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)1 周。本實(shí)驗(yàn)過程符合國(guó)家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理及使用規(guī)定。

1.2.2 內(nèi)臟敏感性評(píng)估 實(shí)驗(yàn)前3 d 將大鼠放入20 cm×8 cm×8 cm的有機(jī)玻璃觀察箱內(nèi)，每天30 min，使大鼠適應(yīng)該密閉環(huán)境，以減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境造成的誤差。在外徑4 mm 硅膠導(dǎo)管的一側(cè)末端，系一長(zhǎng)4～6 cm 的柔軟乳膠指套制成氣囊，導(dǎo)管另一末端與內(nèi)臟擴(kuò)張器連接，實(shí)驗(yàn)前預(yù)擴(kuò)張充氣24 h 檢查氣囊的密閉性。AWR評(píng)分實(shí)驗(yàn)：大鼠給予異氟醚輕微吸入麻醉，然后放入觀察箱，將涂石蠟油的氣囊輕柔地經(jīng)肛門插入大鼠直腸內(nèi)，氣囊末端需深入肛門內(nèi)1～2 cm，在肛門外1 cm 處用膠布將導(dǎo)管緊緊固定在大鼠尾根部，以防止導(dǎo)管移位。氣囊給予不同壓力(20、40、60、80 mmHg)刺激，引起大鼠疼痛，表現(xiàn)為不同程度內(nèi)臟痛引起的行為學(xué)反應(yīng)。大鼠AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，對(duì)結(jié)直腸擴(kuò)張實(shí)驗(yàn)無反應(yīng)性；1 分，大鼠表現(xiàn)為活動(dòng)停頓后短暫頭部運(yùn)動(dòng)行為；2分，大鼠存在腹部肌肉收縮；3分，大鼠有腹部抬起行為；4分，大鼠身體拱起，并抬起盆腔和陰部。

1.2.3 腸道動(dòng)力測(cè)定 大鼠禁食24 h，經(jīng)口灌入印度墨汁0.5 ml，30 min后腹腔注入50 mg/kg 2%戊巴比妥鈉，麻醉起效后處死大鼠并剖腹，取出從賁門至直腸末段的腸段，測(cè)量小腸全長(zhǎng)及墨汁在小腸推進(jìn)的距離，計(jì)算墨汁推進(jìn)距離占小腸全長(zhǎng)的百分比，即為腸道傳輸速率。公式如下：墨汁推進(jìn)率(%)=墨汁在小腸內(nèi)推進(jìn)的距離(cm)/小腸全長(zhǎng)(cm)×100%。

1.2.4 結(jié)腸組織5-HT水平檢測(cè) 將處死后的小鼠結(jié)腸取出，保存于-80℃冰箱。采用ELISA方法檢測(cè)結(jié)腸組織中5-HT的水平。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織5-HT4 受體及ASIC3的表達(dá)水平 將結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)包埋、切片、脫蠟、水化、DAB 顯色、封片等處理，顯微鏡下觀察切片，隨機(jī)選取視野拍照，以5-HT4 受體及ASIC3 表達(dá)陽(yáng)性作為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Image Pro Plus 軟件計(jì)算每張照片的累積光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分比較采用兩因素方差分析，其余指標(biāo)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腸道敏感性比較 隨著氣囊壓力增大，各組間AWR 評(píng)分出現(xiàn)變化：與對(duì)照組比較，NMS 組大鼠腹部疼痛反應(yīng)較重，壓力為40、60、80 mmHg 時(shí)，AWR 評(píng)分明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而NMS+APETx2 組AWR 評(píng)分與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NMS 組比較，壓力為40 mmHg 和80 mmHg 時(shí)，NMS+APETx2 組大鼠AWR評(píng)分明顯降低，腹部疼痛反應(yīng)減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與壓力為20 mmHg時(shí)比較，壓力為40 mmHg 時(shí)的NMS 組，60 mmHg 時(shí)的NMS 組、NMS+APETx2 組，以及80 mmHg 時(shí)的對(duì)照組、NMS組、NMS+APETx2組AWR評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；與壓力為40 mmHg時(shí)比較，壓力為60 mmHg時(shí)的NMS組、NMS+APETx2組及80 mmHg 時(shí)的對(duì)照組、NMS 組、NMS+APETx2 組AWR 評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 或P<0.05)；與壓力為60 mmHg 時(shí)比較，壓力為80 mmHg 時(shí)的對(duì)照組、NMS 組AWR 評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 各組大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分比較(x±s)Tab.1 Comparison of AWR scores of rats in each group under different pressures (x±s)

2.2 各組大鼠腸道動(dòng)力比較 與對(duì)照組(64.55%±3.76%)比較，NMS 組大鼠小腸墨汁推進(jìn)率(46.38%±4.32%)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而NMS+APETx2 組小腸墨汁推進(jìn)率(59.79%±5.26%)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NMS 組比較，APETx2 阻斷ASIC3 后，NMS+APETx2 組大鼠小腸墨汁推進(jìn)率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT 水平變化 與對(duì)照組[(3.71±0.32) mg/ml]比較，NMS 組、MS+APETx2組大鼠結(jié)腸組織5-HT 水平[分別為(66.78±29.69) mg/ml、(26.56±6.38) mg/ml]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與NMS組比較，APETx2阻斷ASIC3后，NMS+APETx2 組大鼠結(jié)腸組織5-HT 水平[(26.56±6.38) mg/ml]明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT4 受體及ASIC3 表達(dá)變化 與對(duì)照組比較，NMS組、MS+APETx2組大鼠結(jié)腸組織5-HT4 受體及ASIC3 表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與NMS 組比較，APETx2阻斷ASIC3后，NMS+APETx2組大鼠結(jié)腸組織5-HT4受體及ASIC3 表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)(圖1)。

圖1 免疫組化測(cè)定大鼠結(jié)腸組織中5-HT4受體(A)及ASIC3(B)表達(dá)水平(DAB)Fig.1 Expressions of 5-HT4 receptor (A) and ASIC3 (B) of rat colon tissue by immunohistochemical analysis (DAB)

3 討 論

IBS是兒童時(shí)期最常見的一種功能性胃腸病，其癥狀的產(chǎn)生與動(dòng)力紊亂、內(nèi)臟高敏感性、黏膜和免疫功能改變、腸道菌群變化及中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能異常有關(guān)。其中，內(nèi)臟高敏感性是IBS 主要的病理生理機(jī)制之一，是胃腸功能紊亂、腹痛及癥狀多樣化的原因，也是IBS 的生物學(xué)標(biāo)志[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，NMS后大鼠腸道敏感性增高，提示NMS可導(dǎo)致IBS 的產(chǎn)生，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-9]。此外，NMS 后結(jié)腸組織中ASIC3 表達(dá)水平明顯升高，而APETx2 阻斷后其結(jié)腸組織中ASIC3 表達(dá)水平則明顯降低，內(nèi)臟敏感性降低，腸道動(dòng)力也明顯好轉(zhuǎn)，提示ASIC3 參與了IBS 內(nèi)臟敏感性的產(chǎn)生，可能與IBS的發(fā)生有關(guān)。

ASICs 是NAC/DEG 鈉通道家族成員，有7 個(gè)不同亞基，廣泛存在于人體內(nèi)；目前在胃腸道炎性疾病如幽門螺桿菌感染所致胃炎、糞菌移植導(dǎo)致的IBS中，與痛覺過敏關(guān)系密切的是ASIC3亞型[3，10]，其激活與細(xì)胞外H+的變化密切相關(guān)。Gregory 等[11]發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)應(yīng)激、缺血缺氧、感染等條件下，肌肉組織出現(xiàn)酸中毒、pH 值下降等改變，ASIC3 表達(dá)明顯增高，疼痛敏感性增高，且ASIC3 表達(dá)水平升高與局部組織的pH值下降呈正相關(guān)。在大量腸道微生物代謝產(chǎn)物(如短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸等)、膽汁酸的作用下，IBS 患兒腸道pH 值明顯降低[12]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，IBS患兒腸黏膜屏障損傷、腸道通透性改變可使腸道內(nèi)毒素水平升高并產(chǎn)生促炎因子，從而引起慢性低度炎癥[13]，也可導(dǎo)致腸道pH 值降低。因此，筆者推測(cè)NMS 法建立的IBS 模型大鼠腸道組織中ASIC3 表達(dá)水平升高與腸道局部pH 值降低有關(guān)。有研究證實(shí)，ASICs在胃腸道信息處理過程中發(fā)揮重要作用，其中ASIC3 主要參與胃腸道機(jī)械敏感性的調(diào)節(jié)，敲除ASIC3可降低胃腸道內(nèi)臟敏感性[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，阻斷ASIC3可降低IBS大鼠的內(nèi)臟敏感性，但ASIC3參與內(nèi)臟敏感性的機(jī)制尚不明確。

5-HT是人體的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。外周神經(jīng)系統(tǒng)中95%的5-HT來源于胃腸道，發(fā)揮調(diào)控胃腸道感覺、運(yùn)動(dòng)及內(nèi)分泌等作用[15]。Qin 等[16]發(fā)現(xiàn)，IBS 患者的腸道在受到炎癥或化學(xué)等刺激時(shí)，嗜鉻細(xì)胞或肥大細(xì)胞可脫顆粒分泌5-HT，使5-HT 水平明顯升高，而5-HT 信號(hào)系統(tǒng)可介導(dǎo)腸道感覺、運(yùn)動(dòng)功能的改變，進(jìn)而出現(xiàn)IBS的臨床表現(xiàn)。Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)，采用電針治療炎癥后的IBS，可使結(jié)腸內(nèi)嗜鉻細(xì)胞數(shù)量減少，5-HT 水平降低，腹部AWR評(píng)分下降，內(nèi)臟痛覺減弱，提示其鎮(zhèn)痛作用可能是通過5-HT 介導(dǎo)的。5-HT 可通過與胃腸道不同效應(yīng)器細(xì)胞上的不同5-HT 受體結(jié)合，調(diào)節(jié)胃腸感覺、運(yùn)動(dòng)及內(nèi)分泌功能，其中5-HT3 受體、5-HT4 受體與腸道動(dòng)力及敏感性關(guān)系尤為密切[18-19]。Fu 等[20]發(fā)現(xiàn)，5-HT3 受體激活后，可刺激神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，從而促進(jìn)平滑肌收縮及腺體分泌，而5-HT4 受體可表達(dá)于腸道神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞及上皮細(xì)胞，其中位于腸道神經(jīng)元的5-HT4受體興奮可增強(qiáng)胃腸道動(dòng)力。人類平滑肌上的5-HT4 受體則可介導(dǎo)平滑肌的舒張，其分布不同，功能有所差異，在腸道內(nèi)主要調(diào)控胃腸道的運(yùn)動(dòng)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，IBS大鼠存在內(nèi)臟高敏感性，結(jié)腸組織中的5-HT 分泌明顯增多，且5-HT4受體、ASIC3表達(dá)水平明顯升高；應(yīng)用ASIC3阻斷劑APETx2 后，IBS 大鼠結(jié)腸組織ASIC3 表達(dá)水平明顯降低，內(nèi)臟高敏感性下降、腸道運(yùn)動(dòng)恢復(fù)，同時(shí)結(jié)腸組織中5-HT 分泌減少、5-HT4 受體表達(dá)水平降低，提示阻斷ASIC3 可改變內(nèi)臟高敏感性，其機(jī)制可能與5-HT、5-HT4受體信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，NMS 后IBS 大鼠腸道組織中ASIC3表達(dá)增加，ASIC3 阻斷劑APETx2 可抑制IBS 大鼠腸道組織ASIC3的表達(dá)，改善IBS大鼠內(nèi)臟敏感性，可能與APETx2 阻斷ASIC3 進(jìn)而抑制5-HT 分泌、下調(diào)5-HT4 受體表達(dá)有關(guān)。因此，ASIC3 可能成為未來IBS內(nèi)臟高敏感性的治療新靶點(diǎn)。但本研究仍存在不足之處，實(shí)驗(yàn)僅設(shè)計(jì)了單一IBS模型探討ASIC3致內(nèi)臟高敏感性及其中5-HT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，后續(xù)可設(shè)計(jì)多種IBS 模型來進(jìn)一步驗(yàn)證ASIC3 致IBS 內(nèi)臟高敏感性的發(fā)生機(jī)制。