博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織鐵死亡相關基因表達譜分析

沈忱悠，聶曉偉，衛(wèi)棟，楊旭生，江成，王偉，盛雅婷，李桂榮*，陳靜瑜*

1南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院移植實驗室，江蘇無錫 214023；2深圳市人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，廣東深圳518020；3南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院移植中心，江蘇無錫 214023

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種威脅生命的肺部疾病[1]，其病死率超過多種腫瘤，發(fā)病群體主要為老年人[2]。IPF的危險因素主要包括年齡、吸煙及環(huán)境污染等[3]。在早期研究中，炎癥被認為是IPF 的主要發(fā)病機制，因此，類固醇療法曾長期被用于IPF的治療。近期研究顯示，肺泡細胞的反復損傷與異常修復導致肺間質纖維化沉積的理論，可更為合理地闡釋IPF 的發(fā)病機制[4]?？估w維化藥物尼達尼布與吡非尼酮由于可延緩疾病進程[5]，已獲批應用于IPF的臨床治療。然而，除肺移植外，目前仍然缺乏治愈IPF 的有效措施[6-7]。鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)的可調控性細胞死亡[8-9]，與凋亡、壞死、自噬等形式的細胞死亡不同，其主要特征為鐵依賴的危害性脂質活性氧積聚[10-11]。越來越多的證據(jù)顯示，鐵死亡與包括肺纖維化在內的多種肺部疾病密切相關。例如，鐵代謝通路中的重要分子谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)表達缺陷型小鼠對博來霉素誘導的肺纖維化更為易感；而在采用GPx4 過表達小鼠構建的IPF 模型中，肺纖維化程度明顯減輕[12]。關于鐵死亡與IPF 的多數(shù)文獻報道，僅明確肺纖維化中存在鐵死亡這一現(xiàn)象，其相關機制仍有待進一步闡明。本研究采用博來霉素誘導建立肺纖維化小鼠模型，運用PCR Array技術篩選該模型中與鐵代謝相關的差異表達基因，探討鐵死亡在IPF發(fā)生中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 博來霉素購自日本化藥株式會社；4%多聚甲醛固定液、瓊脂糖、HE 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Masson 染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；普魯士藍染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑購自美國Sigma 公司；反轉錄試劑盒、定量PCR 試劑盒和小鼠鐵死亡相關基因PCR Array plate試劑盒購自上海沃吉基因科技有限公司。PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。石蠟包埋機購自常州派斯杰醫(yī)療設備有限公司；病理切片機(型號RM2235)購自德國Leica 公司；核酸凝膠電泳系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；超微量紫外分光光度計(型號NanoDrop 2000C)購自美國Thermo 公司；光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；實時熒光定量PCR儀(型號ABI7500)購自美國ABI公司。

1.2 實驗動物及分組 6～7 周齡的SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠12 只，體重20～25 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(蘇)2016-0010]。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境下、通風良好的南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院動物實驗中心小鼠房內，可自由飲水、進食；飼養(yǎng)環(huán)境溫度與濕度適宜，照明12 h、黑暗12 h 交替進行。適應性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機分為對照組和模型組，每組6 只。所有動物護理與實驗均符合南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理管理委員會規(guī)范，全部操作及處理均遵循美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》。

1.3 肺纖維化小鼠模型的制備 參照文獻[13]的方法構建博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉滿意后，左手揪住其頸部皮膚，使其仰臥于手心，小指夾住尾巴固定小鼠，使用微量移液器通過鼻腔給藥方式對模型組小鼠給予5 mg/kg的博來霉素，對照組給予等量生理鹽水。給藥3 周后，使用1%戊巴比妥(100 mg/kg)過量麻醉對兩組小鼠實施安樂死，收集其肺組織。根據(jù)解剖學特征將小鼠肺組織分為五葉，取其中一葉用于組織病理學染色，以評估肺纖維化模型構建是否成功，剩余肺組織存放于-80℃超低溫冰箱，用于后續(xù)差異基因篩選分析等操作。

1.4 小鼠肺組織切片染色 將新鮮取下的小鼠肺組織浸沒于4%多聚甲醛液中固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。包好的蠟塊以5 μm厚度切片，后續(xù)用于HE 染色、Masson 染色及普魯士藍染色，具體操作步驟按相應試劑盒說明書進行。封片后置于光學顯微鏡下觀察，HE染色切片胞質被染成粉紅色或紅色，胞核呈藍色；Masson 染色切片胞質與肌纖維被染成紅色，膠原纖維呈藍色；普魯士藍染色切片胞質含鐵血黃素或三價鐵時被染成藍色，細胞核被染成紅色，其余呈淺紅色或不著色。

1.5 PCR Array 檢測小鼠肺組織鐵死亡相關基因的mRNA 表達 每組隨機選取3 只小鼠，Trizol 法提取肺組織總RNA。使用RNA凝膠電泳評估其質量，超微量紫外分光光度儀檢測其純度與濃度。對質檢合格的RNA 進行反轉錄以合成cDNA 模板，將獲得的cDNA與qPCR預混液按說明書比例混合，以9 μl/孔的用量精準加入Ferroptosis PCR Array Plate (mouse)反應板各孔內，根據(jù)反應推薦程序對樣品進行實時熒光定量PCR測定。

1.6 篩選和分析小鼠肺組織鐵死亡相關的差異表達基因 對于PCR Array檢測獲得的數(shù)據(jù)，采用2-ΔCt法計算倍數(shù)變化值(fold change，F(xiàn)C)，以上調或下調倍數(shù)變化值∣FC∣≥2且P<0.05作為差異基因的篩選閾值。應用R 語言程序包clusterProfiler(4.2.2)對篩選獲得的差異基因進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路預測，其中GO分析涵蓋了生物學中的生物過程、細胞組分和分子功能三個方面。

1.7 實時熒光定量PCR驗證小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因的表達 使用Trizol試劑提取對照組與模型組小鼠肺組織總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，采用定量PCR試劑盒對合成的cDNA模板進行實時熒光定量PCR 擴增，以β-actin為內參基因，以2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.8 小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因在臨床樣本中的表達驗證 通過美國國立生物技術信息中心創(chuàng)建并維護的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，在“GEO Profiles”檢索模式下分別以各差異基因名稱與“idiopathic pulmonary fibrosis”作為關鍵詞檢索相關數(shù)據(jù)集，選取以正常對照與IPF 患者肺組織樣品為基礎的高通量芯片數(shù)據(jù)集，分析各差異基因在相應數(shù)據(jù)集的表達情況。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布時以xˉ±s表示，兩組間比較采用成組樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠肺纖維化模型的建立 HE染色結果顯示，對照組小鼠肺內結構清晰、肺泡間隔正常，無明顯的炎癥細胞浸潤或纖維化形成；模型組小鼠肺部出現(xiàn)肺泡結構大面積破壞，肺泡腔萎縮消失，出現(xiàn)明顯的肺間質纖維化及大量炎性細胞浸潤。Masson 染色結果顯示，對照組小鼠肺泡結構正常、藍染區(qū)域較少且著色淺，未見明顯的膠原沉積；與對照組比較，模型組小鼠肺泡結構完全丟失，膠原纖維所對應的藍染區(qū)域明顯增加、著色加深，且部分肺泡被膠原覆蓋(圖1)。

圖1 兩組小鼠肺組織HE和Masson染色結果(×100)Fig.1 HE and Masson staining of lung tissue in two groups of mice (×100)

2.2 兩組小鼠肺組織鐵沉積情況 普魯士藍染色結果顯示，對照組小鼠肺泡結構清晰，肺泡腔與間隔內未見明顯的藍色顆粒，鐵染色結果為陰性；與對照組比較，模型組小鼠肺組織結構紊亂，肺間質內出現(xiàn)一定數(shù)量的藍染顆粒，鐵染色結果呈陽性(圖2)。

圖2 兩組小鼠肺組織鐵沉積情況(普魯士藍染色，×400)Fig.2 Iron-deposit in lung tissue of two groups of mice (Prussian blue staining, ×400)

2.3 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關基因表達譜 分別提取兩組小鼠肺組織RNA，反轉錄后行PCR Array檢測，將上調或下調倍數(shù)變化值∣FC∣≥2 且P<0.05 作為篩選條件對結果進行分析。熱圖可體現(xiàn)樣本與差異表達基因的聚類分布情況。本次Array所檢測的90個鐵死亡相關基因中，紅框標注的5 個基因在對照組與模型組中各自積聚到一個集中區(qū)域(圖3)。利用火山圖觀察兩組樣本鐵死亡相關基因表達水平的差異分布，結果也同樣顯示，與對照組比較，模型組中有5 個基因存在差異表達，即碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)、半胱氨酰-tRNA 合成酶1(cysteinyltRNA synthetase 1，CARS1)、熱休克轉錄因子(heat shock transcription factor 1，HSF1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3(NADPH oxidase 3，NOX3)和線粒體鐵蛋白(mitochondrial ferritin，F(xiàn)TMT)基因，其表達變化方向均為下調(P<0.05，圖4)。

圖3 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關基因表達熱圖Fig.3 Heat map of genes related to ferroptosis in two groups of mice

圖4 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因火山圖Fig.4 Volcano plot of differentially expressed genes related to pulmonary ferroptosis in two groups of mice

2.4 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因的功能富集分析 GO富集結果顯示，差異基因在生物過程方面主要參與體溫內穩(wěn)態(tài)、鹽反應、微管結合調控、鐵離子的細胞內固等進程，細胞組分方面主要涉及NADPH氧化酶復合體、前核、分子伴侶復合體、著絲粒等組分，分子功能方面主要與STAT 家族蛋白結合、碳酸脫氫酶活性、三價鐵結合、二價鐵結合、氨酰連接酶活性等功能相關(圖5)。KEGG信號通路預測結果顯示，除鐵死亡外，差異基因還參與氮素代謝、氨酰的生物合成、軍團菌病通路等過程(圖6)。

圖5 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of DEGs related to pulmonary ferroptosis in two groups of mice

2.5 小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因在肺纖維化模型中的表達驗證 采用RT-qPCR 檢測5 個差異基因在對照組與模型組小鼠肺組織中的表達情況，結果顯示，與對照組比較，模型組CA9、CARS1、FTMT及HSF1的表達量均明顯降低(P<0.05)，而兩組NOX3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖7)。

圖7 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因表達驗證Fig.7 Validation of differentially expressed genes related to pulmonary ferroptosis in two groups of mice by RT-qPCR

2.6 小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因在IPF 臨床樣本中的表達驗證 檢索GEO數(shù)據(jù)庫，結果顯示目標差異基因在兩個滿足篩選條件的數(shù)據(jù)集中有表達，其中CA9和HSF1表達于GDS1252數(shù)據(jù)集，CARS1和NOX3表達于GDS4279數(shù)據(jù)集，F(xiàn)TMT則未檢索到符合樣本條件的數(shù)據(jù)集。對上述差異基因在其相應數(shù)據(jù)集中的表達量進行分析，結果顯示，CA9、HSF1、CARS1及NOX3在IPF臨床肺組織樣本中的表達模式與本研究兩組小鼠肺組織PCR Array檢測結果中的表達模式一致，差異均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 小鼠肺組織鐵死亡相關差異基因在臨床樣本中的表達情況Tab.2 Expression of differentially expressed genes related to mouse pulmonary ferroptosis in clinical samples

3 討 論

IPF作為一種慢性、進展性、年齡相關的間質性肺部疾病，因其發(fā)病率較高、發(fā)病機制尚未明確、病程不可逆且預后不良而成為當前社會經(jīng)濟的潛在負擔之一[14]。近年研究顯示，IPF患者感染新冠肺炎病毒后，發(fā)展為重癥新冠肺炎的風險較非IPF 感染者增高[15]。鑒于上述特征，深入研究IPF 發(fā)病機制、尋找有效的早期診斷與治療靶點迫在眉睫。

有多種動物模型先后被用于IPF 發(fā)病機制的研究[16]，但由于疾病本身的獨特性及其復雜的病理生理學機制，科學家們尚未發(fā)現(xiàn)能夠完全復制IPF 發(fā)生的體內模型。目前用于IPF 研究的動物模型須具備肺部損傷、無休止的修復以及過量瘢痕形成等三要素[17]。常見的肺纖維化動物模型構建方式包括博來霉素、二氧化硅、石棉等藥物誘導，輻射誘導，基因工程誘導等，其中氣管滴注法給予博來霉素因其模型動物肺部發(fā)生強烈的纖維化反應、與IPF 患者相似的組織學特征以及相對低廉的造模成本而被廣泛應用于IPF發(fā)病機制研究[16,18]。

鐵死亡作為一種鐵依賴型細胞死亡調控方式，由Dixon 等[10]于2012 年首次報道。研究顯示，鐵死亡可參與有機體的多種生理與病理進程，在卒中、腦損傷和腫瘤等多種疾病中起重要作用[19-20]。盡管鐵元素為機體細胞正常生理過程所必需，但過量的鐵累積會導致胞內脂質過氧化物含量增加，進而觸發(fā)鐵死亡[21]。一些被認定為鐵死亡標志或調控因子的基因可參與慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷、哮喘、肺癌等多種良性與惡性肺部疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。值得注意的是，IPF患者肺組織中鐵含量升高，且鐵元素的積聚與氣道纖維化程度及肺功能密切相關[23]。本研究博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠肺組織鐵染色呈陽性，提示模型組小鼠肺部有鐵元素沉積，與IPF的上述特征相符。在轉化生長因子β誘導的肺纖維化細胞模型中，鐵死亡誘導劑可通過促進脂質過氧化以及降低GPX4表達而加速成纖維細胞向效應方向分化，而鐵死亡抑制劑則可通過降低脂質過氧化和增強GPX4 表達而抑制肺纖維化與鐵死亡的發(fā)生[24]。在博來霉素誘導的肺纖維化模型中，抑制長鏈非編碼RNA 鋅指反義鏈1 的表達可顯著減弱博來霉素引起的脂質過氧化作用，從而抑制鐵死亡，緩解肺纖維化[25]。亦有研究顯示，IPF患者的支氣管肺泡灌洗液中，某些與鐵代謝或纖維化相關的標志分子表達紊亂[26]。上述研究成果均提示鐵死亡可能在IPF發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

PCR Array 作為一種以功能分類的PCR陣列芯片技術，結合了實時定量PCR 準確靈敏的特性與微陣列芯片檢測通量大的優(yōu)勢，可一次性檢測多種基因的表達，是分析信號通路或某些生理功能、病理進程相關基因表達變化的首選工具之一[27]。本研究選用的小鼠鐵死亡相關基因PCR Array包含了鐵死亡通路中90個關鍵基因，涉及鐵代謝、氨基酸與谷胱甘肽代謝、脂質代謝等參與調控鐵死亡的生物過程。本研究PCR Array檢測顯示，與對照組比較，模型組共有5 個差異基因，分別為CA9、CARS1、HSF1、NOX3和FTMT，其表達變化方向均為下調。本研究通過實時定量PCR實驗與GEO數(shù)據(jù)庫挖掘分別驗證了5個差異基因在IPF模型小鼠與臨床患者肺組織中的表達，結果顯示差異基因在動物實驗中的表達情況與PCR Array結果基本一致，在肺纖維化臨床樣本中的表達模式與PCR Array 測得的模式也基本相符，但后者表達差異無統(tǒng)計學意義，這可能與各類基因芯片及高通量測序數(shù)據(jù)中檢測鐵死亡相關特異性基因的數(shù)據(jù)集較少，以及目前檢索到的兩個數(shù)據(jù)集中樣本量有限等因素有關。

CA9 是一種跨膜蛋白，屬于功能龐大的碳酸酐酶家族，其主要成分為酸性氨基酸，在生理狀態(tài)下具有維持細胞外基質酸堿平衡的重要作用[28]；病理狀態(tài)下，CA9 參與調控實體腫瘤的微環(huán)境，且其表達量與多種腫瘤預后密切相關，已成為當下腫瘤研究領域的熱點基因，是評估抗腫瘤治療效果的潛在分子標志物[29]。FTMT是重要的線粒體鐵儲存蛋白，具有鐵氧化酶活性，可通過催化二價鐵向三價鐵轉化實現(xiàn)鐵元素的存儲[30-31]?，F(xiàn)有研究提示，F(xiàn)TMT的主要功能為保護組織特異性細胞免受鐵元素依賴的氧化損傷，而非直接調控細胞鐵含量[32]；Wang等[33]在體外研究中發(fā)現(xiàn)FTMT 可通過降低細胞不穩(wěn)定鐵池儲量及胞質活性氧生成而抑制鐵死亡。盡管CA9及FTMT在IPF中的作用鮮有報道，但兩者均被認為是鐵死亡的抑制因子[33-34]；而鐵死亡通路在IPF中呈活化狀態(tài)，故CA9與FTMT基因在本研究IPF模型中的表達量降低與鐵死亡通路的改變相一致，提示這兩個基因可能通過鐵死亡通路參與了IPF 的疾病發(fā)生過程。HSF1作為一種在溫度上升等應激狀態(tài)下可被迅速誘導并表達的轉錄因子，在生物體生命活動的各階段、各器官組織中廣泛表達，具有調節(jié)生長發(fā)育、抗凋亡、保護心臟缺血性損傷等功能，并在對抗呼吸機導致的肺部機械損傷性炎癥、炎性腸病、類風濕關節(jié)炎，以及革蘭陰性菌感染導致的內毒素血癥等炎癥相關疾病中發(fā)揮重要作用[35-36]。Chen等[37]的研究顯示，HSF1可促進人胚肺成纖維細胞的增殖和纖維化轉變，敲低HSF1則可抑制細胞的纖維化進程，這與本研究HSF1在肺纖維化模型中表達量降低的結果并不一致；考慮到HSF1強大的抗炎作用以及炎癥反應在肺纖維化中的重要地位，HSF1在本研究中表達量下降或可理解為其在肺纖維化中的抗炎作用大于促纖維化作用。然而影響疾病潛伏與發(fā)生的因素通常錯綜復雜，基因的表達也存在著時空特異性，故HSF1在IPF中的作用仍值得進一步探究。本研究篩選得到的另外兩個差異基因CARS1與NOX3均為鐵死亡通路中的驅動因子，分別行使著抑制腫瘤發(fā)生和參與內耳石形成的重要功能[10,38]，但兩者與IPF 的關系鮮有報道，加之對本次PCR Array 的驗證實驗中NOX3表達量在模型組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義，提示CARS1與NOX3在IPF中的表達變化及其作用有待進一步驗證與探索。

為進一步探究鐵死亡在IPF 中的作用，本研究對篩選所得的差異基因開展了功能富集性分析，其結果或可為探究IPF 的發(fā)生機制提供一定參考。GO與KEGG 分析結果顯示，差異基因主要與體溫內穩(wěn)態(tài)、NADPH氧化酶復合體、碳酸脫氫酶活性等功能有關，主要通過氮素代謝、氨酰的生物合成、軍團菌病等信號通路參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。已有研究顯示氮素代謝參與調控IPF的發(fā)生[39-40]，早年報道中亦有急性軍團菌肺炎患者并發(fā)肺纖維化的案例[41]。

綜上所述，本研究通過建立博來霉素誘導的小鼠IPF 模型，檢測其肺組織鐵死亡通路相關基因的表達變化，針對篩選所獲的差異基因開展生物信息學分析及表達驗證，并結合現(xiàn)有文獻報道初步討論了其在IPF 中的潛在作用。本研究以鐵死亡為切入點，為IPF的機制探索提供了新思路，也為IPF的早期診斷與治療提供了潛在的分子標志物與用藥靶點。下一步，我們將結合體外與體內實驗研究各差異基因通過鐵死亡通路調控IPF發(fā)生的具體機制。