延髓背側(cè)網(wǎng)狀核膠質(zhì)細(xì)胞活化參與大鼠咬合干擾致口頜面痛覺敏感的中樞機(jī)制

許永偉，范瑩瑩，曹燁，陸支越，金建秋*

1北京大學(xué)人民醫(yī)院口腔科，北京 100044；2北京醫(yī)院口腔科/國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 100730；3北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院修復(fù)科/口頜功能診療研究中心/國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室/口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

機(jī)體疼痛下行調(diào)制(descending pain modulation)系統(tǒng)的下行易化(促進(jìn)疼痛感受)和下行抑制(抑制疼痛感受)作用是協(xié)調(diào)工作的，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，則出現(xiàn)下行調(diào)制的失衡：如果下行易化處于優(yōu)勢(shì)，則表現(xiàn)為疼痛感受加重；如果下行抑制占主導(dǎo)，則表現(xiàn)為疼痛感受遲鈍或缺失[1-3]。疼痛下行調(diào)制系統(tǒng)的主要組成部分包括延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)(rostral ventromedial medulla，RVM)、延髓尾端腹外側(cè)區(qū)(caudal ventrolateral medulla，VLM)和延髓網(wǎng)狀背側(cè)亞核(dorsal reticular nucleus，DRt)等[1-3]。RVM-VLM-DRt之間存在緊密的環(huán)路聯(lián)系，在下行調(diào)制機(jī)制中具有重要作用。RVM的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制是下行調(diào)制的中繼站，已有較多深入的研究[1-3]。而目前關(guān)于DRt 的研究較少，少量研究?jī)A向于認(rèn)為DRt 主要參與下行易化調(diào)制[4]。目前的研究主要針對(duì)DRt神經(jīng)元機(jī)制，尚未見關(guān)于膠質(zhì)細(xì)胞在DRt參與的下行調(diào)制中的作用。本研究將利用課題組成熟的對(duì)咬合干擾致口頜面痛覺敏感模型[5-6]，對(duì)DRt 膠質(zhì)細(xì)胞參與咬合干擾所致口頜面疼痛的機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為口頜面疼痛的治療提供新的靶向腦區(qū)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠33 只，體重180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。24 h 晝夜交替，室溫25 ℃。自我賞罰實(shí)驗(yàn)大鼠測(cè)試日預(yù)先禁食不禁水，其余時(shí)間自由飲食飲水；其余實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)審批(LA2019353、LA2019354)。

1.2 大鼠自我賞罰行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 將24 只SD 大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、痛覺敏感維持組、痛覺敏感維持+DRt 損毀組，每組8 只。其中，假手術(shù)組大鼠于1%戊巴比妥鈉全麻下保持開口5 min，但不粘固牙冠；痛覺敏感維持組參考課題組既往的實(shí)驗(yàn)方法[5]建立實(shí)驗(yàn)性咬合干擾(experimental occlusal interference，EOI)模型，EOI后8 d在1%戊巴比妥鈉全麻下，用尖探針去除金屬冠；痛覺敏感維持+DRt 損毀組于DRt損毀后1 周建立EOI 模型8 d 后去除金屬冠，損毀藥物使用1 g/μl 鵝膏簟氨酸(ibotenic acid，IBO，MCE公司，中國(guó))。實(shí)驗(yàn)大鼠在1%戊巴比妥鈉麻醉下，將頭部固定在腦立體定位儀上，根據(jù)大鼠腦圖譜確定DRt坐標(biāo)為前囟點(diǎn)后15 mm，左右旁開1.4 mm，從小腦表面進(jìn)入，深度為6.5 mm。IBO 用生理鹽水稀釋至1 μg/μl。使用前1 d配制。將1 μl的尖頭微量注射器連接于微量注射泵上，雙側(cè)DRt給予0.3 μl IBO，持續(xù)5 min，注射后繼續(xù)留針3 min以防止藥物反溢。注射后縫合大鼠頭部傷口，實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后恢復(fù)1 周后EOI，EOI 后8 d 去除咬合干擾。大鼠自我賞罰行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用Ugo Basile 面部疼痛測(cè)試儀(Ugo Basile Orofacial Stimulation Test System，ComerioVA，意大利)，具體測(cè)試方法參考文獻(xiàn)[7]。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 The flowchart of experimental design

采用盲法(測(cè)試者不知道動(dòng)物分組情況)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，記錄各組大鼠EOI，以及EOI 7、10、14 d 的自我賞罰實(shí)驗(yàn)結(jié)果及體重。

1.3 DRt 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 將9 只SD 大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(n=3，處理同1.2)、痛覺敏感維持組(n=3，EOI 8 d 去除EOI 前)及痛覺敏感維持組6 d(n=3，EOI 8 d 去除EOI 后6 d)。用1%戊巴比妥鈉過量麻醉大鼠后行左心室灌注。先用250 ml 溫?zé)嵘睇}水快速灌注，約300 ml 4%多聚甲醛灌流，然后取腦干及延髓以閂為中心頭向4 mm，尾向1 mm 組織塊，放入4%多聚甲醛中固定、OCT 包埋，冰凍切片，厚度為20 μm，每隔3片取出一片置于0.01 mol/L PBS溶液多孔皿中。取出4 ℃冰箱保存的組織漂片以0.01 mol/L PBS 浸泡，10%驢血清封閉液室溫封閉60 min，加入小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物(OX-42)(1∶200，Abcam，美國(guó))或膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(1∶400，CST，美國(guó))，4 ℃孵育過夜；0.01 mol/L PBS 浸泡，驢抗小鼠IgG 1∶200 室溫孵育90 min；0.01 mol/L PBS 浸泡、貼片、自然風(fēng)干；防淬滅熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍片。熒光照片規(guī)格為512×512 像素，保證相同增益及曝光條件下進(jìn)行半定量分析。使用ImageJ 軟件對(duì)GFAP、OX-42 的熒光面積及熒光強(qiáng)度進(jìn)行半自動(dòng)分析，每只大鼠選擇5 張腦切片進(jìn)行分析。參考Colburn 的膠質(zhì)細(xì)胞活化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)大鼠DRt 水平膠質(zhì)細(xì)胞活化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)?；A(chǔ)染色：膠質(zhì)細(xì)胞體積正常，均勻散在分布，伸出廣泛細(xì)長(zhǎng)的分支；輕度活化：膠質(zhì)細(xì)胞染色微增強(qiáng)，呈分支狀均勻分布；中度活化：膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，染色增強(qiáng)，突起變短增粗，部分細(xì)胞之間有交疊；重度活化：膠質(zhì)細(xì)胞胞體肥大，染色強(qiáng)陽(yáng)性，突起短且粗，細(xì)胞相互之間重疊分布呈團(tuán)塊狀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布者以x±s表示，各組不同時(shí)間點(diǎn)的自我賞罰行為學(xué)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；各組相同時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械刺激反應(yīng)閾值與自我賞罰行為學(xué)結(jié)果采用多因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞染色結(jié)果進(jìn)行多因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 假手術(shù)組、痛覺敏感維持組及痛覺敏感維持+DRt損毀組大鼠在測(cè)試期間體重均出現(xiàn)緩慢增加，但各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2A)。

圖2 不同組實(shí)驗(yàn)大鼠體重情況與自我賞罰實(shí)驗(yàn)行為學(xué)表現(xiàn)Fig.2 Time course of body weight and orofacial operant test in different groups of rats

2.2 DRt 損毀對(duì)大鼠自我賞罰痛覺敏感維持的影響 與假手術(shù)組比較，痛覺敏感維持組大鼠在8 d去除咬合干擾后總攝食時(shí)間縮短，在10、14 d 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10 d：(190.8±28.6) svs.(293.3±31.4) s；14 d：(179.6±34.4) svs.(309.2±19.2) s；P<0.05]。而痛覺敏感維持+DRt損毀組大鼠在8 d去除咬合干擾后，總攝食時(shí)間延長(zhǎng)，在14 d 時(shí)總攝食時(shí)間明顯長(zhǎng)于痛覺敏感維持組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(286.1±17.1) svs.(179.6±34.4) s，P<0.05]；在10、14 d時(shí)與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10 d：(241.6±20.4) svs.(293.3±31.4) s；14 d：(286.1±17.1) svs.(309.2±19.2) s；P<0.05，圖2B]。

2.3 痛覺敏感維持模型中去除咬合干擾對(duì)DRt 星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 免疫染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組GFAP 陽(yáng)性染色位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和突起，從較小的胞體向周圍發(fā)出細(xì)絲狀分支，呈現(xiàn)為基礎(chǔ)染色；痛覺敏感維持組星形膠質(zhì)細(xì)胞與假手術(shù)組比較無明顯變化；痛覺敏感維持組6 d星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，分支變粗增多，染色增強(qiáng)，部分分支偶有交疊，呈現(xiàn)為中度活化(圖3A)。半定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，痛覺敏感維持組星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP 熒光強(qiáng)度及熒光面積變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而痛覺敏感維持組6 d 星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP 熒光強(qiáng)度及熒光面積均明顯增高(P<0.05)，且痛覺敏感維持組6 d 與痛覺敏感維持組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3B)。

圖3 各組大鼠GFAP免疫熒光染色變化(A)及半定量分析(B)Fig.3 Expression of GFAP immunofluorescence staining (A) and semiquantitative analysis (B) in the rats of each group

2.4 痛覺敏感維持模型中去除咬合干擾對(duì)DRt 小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 免疫染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組OX-42 染色陽(yáng)性表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和突起，從較小的胞體向周圍發(fā)出爪狀分支，呈現(xiàn)為基礎(chǔ)染色；痛覺敏感維持組小膠質(zhì)細(xì)胞與假手術(shù)組比較無明顯變化；痛覺敏感維持組6 d 小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，分支變粗增多，染色增強(qiáng)，部分聚集成團(tuán)狀，呈現(xiàn)為中度活化(圖4A)。半定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，痛覺敏感維持組6 d 小膠質(zhì)細(xì)胞的OX-42熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但熒光面積較假手術(shù)組明顯增大(P<0.05)，而痛覺敏感維持組OX-42熒光強(qiáng)度及熒光面積與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且痛覺敏感維持組6 d與痛覺敏感維持組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4B)。

圖4 各組大鼠OX-42免疫熒光染色變化(A)以及半定量分析(B)Fig.4 Expression of OX-42 immunofluorescence staining (A) and semiquantitative analysis (B) in the rats of each group

3 討 論

慢性口頜面疼痛是臨床治療的困境，臨床上可觀察到咬合因素相關(guān)的口頜面疼痛患者在咬合因素去除后的轉(zhuǎn)歸不同，部分患者早期去除咬合因素后疼痛可緩解，而另一部分患者即使咬合因素去除后疼痛仍然存在。本課題組前期建立了一個(gè)接近臨床、刺激可隨時(shí)去除、可模擬不同痛覺敏感狀態(tài)的咬合干擾相關(guān)的口頜面疼痛動(dòng)物模型，證實(shí)在大鼠咬合干擾后8 d去除咬合干擾，大鼠的頜面部痛覺敏感仍持續(xù)存在，這與臨床上患者長(zhǎng)時(shí)間存在咬合相關(guān)頜面部疼痛時(shí)對(duì)因治療(去除咬合)無效的情況相符[9-10]。因此，研究者對(duì)口頜面疼痛的下行調(diào)制機(jī)制進(jìn)行了系列研究，揭示了不同痛覺敏感轉(zhuǎn)歸狀態(tài)的下行調(diào)制機(jī)制動(dòng)態(tài)變化[5-6]，且發(fā)現(xiàn)了RVM內(nèi)介導(dǎo)下行易化調(diào)制的ON-神經(jīng)元和下行抑制調(diào)制的OFF-神經(jīng)元的可塑性變化及二者的功能失衡在不同痛覺敏感轉(zhuǎn)歸狀態(tài)下的作用，且RVM星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了口頜面痛覺敏感維持的下行調(diào)制[5-6]。而DRt 是參與下行易化機(jī)制的重要腦區(qū)，其能夠接受來自RVM以及更高級(jí)中樞的調(diào)控信息，最終將下行調(diào)控信號(hào)投射至脊髓，這是本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要基礎(chǔ)[4]。

本研究中，損毀DRt 痛覺敏感維持模型去干擾前疼痛表現(xiàn)與未損毀時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在去干擾后疼痛逆轉(zhuǎn)，提示DRt 在該模型去干擾后的痛覺敏感維持期起下行易化作用。在外界刺激存在時(shí)，DRt 膠質(zhì)細(xì)胞無明顯活化，而當(dāng)去除外界刺激后，疼痛上行傳遞通路作用減弱，但疼痛仍未恢復(fù)，此時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞活化，提示DRt 的膠質(zhì)細(xì)胞是痛覺敏感維持期下行易化的相關(guān)機(jī)制之一。

DRt 中的膠質(zhì)細(xì)胞參與下行易化的具體機(jī)制尚不明確，但下行易化的信號(hào)最終需要通過神經(jīng)纖維傳遞，而神經(jīng)元作為神經(jīng)纖維疼痛信號(hào)傳遞的基礎(chǔ)在疼痛的產(chǎn)生與傳遞中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)上行傳遞通路的研究已發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞間存在著密切的相互作用。以脊髓為例，外周炎癥或損傷后初級(jí)傳入神經(jīng)末梢會(huì)釋放趨化因子、炎性介質(zhì)等作用于膠質(zhì)細(xì)胞受體，刺激膠質(zhì)細(xì)胞活化。膠質(zhì)細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶磷酸化導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6等]的產(chǎn)生及釋放，這些促炎細(xì)胞因子一方面通過自分泌或旁分泌的方式形成自反饋?zhàn)饔?，另一方面能夠與神經(jīng)元受體結(jié)合，增強(qiáng)神經(jīng)元活性。有研究顯示，IL-1β、TNF-α能夠促進(jìn)突觸后N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的突觸傳遞并增加這類受體在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的表達(dá)；膠質(zhì)細(xì)胞的活化與神經(jīng)元細(xì)胞的敏化之間相互促進(jìn)，形成了慢性疼痛機(jī)制中脊髓背角的一個(gè)正反饋循環(huán)[11-12]。在下行調(diào)制研究中，部分研究也指出下行調(diào)制系統(tǒng)中神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞間可能存在類似的作用機(jī)制[13-14]。Wei等[13]發(fā)現(xiàn)，在三叉神經(jīng)病理性疼痛大鼠中，RVM的小膠質(zhì)細(xì)胞在建模后1～3 d 出現(xiàn)早期活化，隨后在RVM 還出現(xiàn)了持續(xù)至少28 d 的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并在14 d 出現(xiàn)峰值；RVM注射膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑可明顯減弱手術(shù)誘導(dǎo)的機(jī)械痛覺敏感。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RVM的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β作用于神經(jīng)元的NMDA受體，使NMDA受體磷酸化，提示RVM星形膠質(zhì)細(xì)胞活化分泌的TNF-α和IL-1β參與了維持神經(jīng)病理性疼痛的脊髓上機(jī)制。Ni 等[14]發(fā)現(xiàn)，在骨癌疼痛模型中趨化因子CXC配體-受體趨化因子CXC受體2 信號(hào)通路參與了中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用下的下行易化。一項(xiàng)關(guān)于脊髓注射5-羥色胺3(5-HT3)受體激動(dòng)劑誘發(fā)機(jī)械痛覺敏感的研究發(fā)現(xiàn)，注射后出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞敏化、細(xì)胞因子IL-18 表達(dá)上調(diào)、膠質(zhì)細(xì)胞活化，神經(jīng)元-細(xì)胞因子-膠質(zhì)細(xì)胞間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能與5-HT3受體介導(dǎo)的下行易化相關(guān)[12]。上述研究提示，膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的相互作用可能是本研究中膠質(zhì)細(xì)胞參與咬合干擾致口頜面痛覺敏感維持的具體機(jī)制。

本研究采用自我賞罰實(shí)驗(yàn)進(jìn)行痛覺敏感測(cè)試。自我賞罰實(shí)驗(yàn)允許動(dòng)物在接受獎(jiǎng)賞或逃避傷害性刺激間做出選擇，與反射行為測(cè)試方法相比更客觀，更能反映動(dòng)物高級(jí)中樞對(duì)傷害性刺激加工后的表現(xiàn)[15-16]。臨床上亦可觀察到咬合干擾相關(guān)口頜面疼痛患者，其焦慮、抑郁等評(píng)分較高[17-18]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，海馬、前扣帶回等均參與了咬合干擾致口頜面痛覺敏感的中樞機(jī)制[19-20]，提示該咬合干擾模型的疼痛特點(diǎn)與情緒認(rèn)知高級(jí)中樞功能活動(dòng)等相關(guān)。因此，使用自我賞罰實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合反射行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果可更全面地反映該模型的行為學(xué)特點(diǎn)。該方法能夠反映高級(jí)中樞對(duì)疼痛的整合，且在實(shí)驗(yàn)過程中操作方便，實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)期訓(xùn)練結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)人員每次測(cè)試僅需安裝操作儀器，并不需要對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠反復(fù)操作，可減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的恐懼、緊張等心理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，大鼠攝食水平穩(wěn)定。但該方法也存在一些缺點(diǎn)：如實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，適應(yīng)期訓(xùn)練即需要2～3周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在訓(xùn)練失敗的可能；實(shí)驗(yàn)前還需對(duì)大鼠禁食。綜上，自我賞罰實(shí)驗(yàn)是頜面部痛覺敏感測(cè)定的一種可靠、易行的行為學(xué)方法。

綜上所述，本研究探索了大鼠咬合干擾去除后痛覺敏感維持模型中DRt 膠質(zhì)細(xì)胞活化參與口頜面痛覺敏感的中樞機(jī)制，對(duì)臨床問題有一定提示意義。但本研究也存在一些局限：雖然發(fā)現(xiàn)咬合干擾后痛覺敏感維持與DRt 膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)，且膠質(zhì)細(xì)胞可能起下行易化作用，但并未進(jìn)一步探索膠質(zhì)細(xì)胞下行易化的深入機(jī)制。因此，未來可進(jìn)一步關(guān)注下行調(diào)制機(jī)制中膠質(zhì)細(xì)胞的具體作用機(jī)制、神經(jīng)元的作用及神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用等，以研究更高級(jí)中樞在頜面部疼痛中的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，助力于減少頜面部慢性疼痛的發(fā)生，緩解疼痛患者的癥狀，促進(jìn)其身心健康。