杜馬斯燃燒法測定奶粉中蛋白質(zhì)的方法研究

劉琳，高波

（黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱 150028）

0 引 言

奶粉是以哺乳類動物鮮乳為原料[1-3]，添加或不添加營養(yǎng)強化劑，通過特定工藝加工而成的粉狀食品。奶粉營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)作為其中最主要的營養(yǎng)成分[4-5]，含量高低是評定奶粉品質(zhì)的重要依據(jù)。因此，精準、穩(wěn)定、快速、高效測定奶粉中蛋白質(zhì)含量十分重要。

檢測蛋白質(zhì)含量的方法很多[6-14]，凱氏定氮法、比色法、燃燒法[15]應用廣泛。但前2 種方法耗時、費力、有污染、不安全[16]，燃燒法測定蛋白質(zhì)含量所使用的主要儀器為杜馬斯定氮儀，分析過程3～6 min，9 成以上的工作由儀器自主完成[17]。實驗無需使用腐蝕性試劑，僅產(chǎn)生少量灰分殘渣。近年來，國內(nèi)外雖然對燃燒法的關注有所提升，但國內(nèi)對此相關的研究依舊限于凱氏定氮法和燃燒法之間的對比[18-21]，缺少采用燃燒法來檢測特定基質(zhì)中蛋白質(zhì)含量工藝參數(shù)優(yōu)化的研究。奶粉含水率低、均勻性好，采用燃燒法進行大批量奶粉中蛋白質(zhì)的測定優(yōu)勢明顯。為此，本研究以奶粉為對象，通過單因素試驗建立杜馬斯燃燒法測定蛋白質(zhì)含量的最優(yōu)分析條件并進行驗證[22]，為杜馬斯燃燒法快速測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的廣泛應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

幼兒配方奶粉，市售；天（門）冬氨酸aspartic acid標準物質(zhì)（GBW(E)100080，N 理論含量10.52%），山東亞學生物科技有限公司；混合催化劑，瑞典FOSS 公司；高純氧氣、高純二氧化碳，山東魯中氣體有限公司。

1.2 主要儀器

Rapid N cube 氮分析儀，德國Elementar 公司；8400 全自動蛋白質(zhì)滴定儀，瑞典FOSS 公司；精確度0.1 mg 電子天平，瑞士梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 參數(shù)設置

溫度參數(shù)設置。熱導檢測器溫度：60 ℃；燃燒管溫度：960 ℃；二級燃燒管溫度：800 ℃；還原管溫度：815 ℃。

O2壓力設置。O2減壓閥輸出壓力：0.22 MPa。

CO2壓力設置。Input 顯示值：0.12～0.125 MPa；MFC-CO2顯示值：約650 mL/min；Flow-CO2顯示值：約650 mL/min。

定義標準物質(zhì)。選用N 理論含量為10.52%的天（門）冬氨酸aspartic acid 作為校準樣品，設置N 測試允許的偏差為5%。

1.3.2 標準品及檢測樣品的制備

取均勻、干燥的標準品和奶粉樣品，稱重后用錫箔包裝制片。樣品制備過程需用鑷子或帶上手套，確保包裝材料不受人為污染。包裹樣品后，對包裝進行擠壓、趕盡空氣。

1.3.3 執(zhí)行樣品測試

輸入標準品及樣品信息、設定通氧方法后，用鑷子夾取樣品放入進樣盤相應的孔位后，啟動分析測試。分析測試結(jié)束后，校正測試數(shù)據(jù)、打印測試結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 稱樣量的選擇

在相同的通氧條件下（氧氣流量300 mL/min，通氧時間140 s），取同一均勻性奶粉樣品，選取不同稱樣量作為一個分析水平進行氮含量測定，同一水平連續(xù)測定6 次，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同稱樣量對氮含量測定結(jié)果的影響（n=6）

由表1 可見，稱樣量在≤150 mg、≥250 mg 時，結(jié)果的相對標準偏差較高；稱樣量為250、300 mg 時，氮含量測定結(jié)果偏高。分析其原因，可能當稱樣量少時，檢測樣品代表性不強，加之天平及稱量操作的系統(tǒng)誤差凸顯，從而影響檢測的準確性；當取樣過多時，樣品的燃燒不夠充分，進入檢測器中的目標物質(zhì)少，加大分析結(jié)果誤差。另一方面，樣品由于燃燒不完全，會產(chǎn)生與氮氣熱導系數(shù)相近的一氧化碳氣體，通過熱導檢測器，顯示結(jié)果虛高。所以在進行奶粉中蛋白質(zhì)含量的測定時，稱樣質(zhì)量選擇200 mg 比較合適。

2.2 氧氣流量的選擇

稱?。?00±20）mg 奶粉樣品，設定不同的氧氣流量，在相同的通氧時間（140 s）條件下，同一水平對其氮含量連續(xù)測定6 次，結(jié)果如表2 所示。

表2 不同氧氣流量對氮含量測定結(jié)果的影響（n=6）

由表2 可見，通氧量不足或通氧過快都會導致樣品燃燒不充分，使得試驗的誤差加大。所以，綜合考慮測定結(jié)果的RSD 值及測試耗費因素，設定200 mL/min的氧氣流量進行奶粉中蛋白質(zhì)含量的測定較為合理。

2.3 通氧時間的選擇

稱取（200±20）mg 奶粉樣品，在200 mL/min 的氧氣流量條件下，分析不同的通氧時間對氮含量檢測結(jié)果的影響，同一水平連續(xù)進行6 次測定，結(jié)果如表3所示。

表3 不同通氧時間對氮含量測定結(jié)果的影響（n=6）

由表3 可見，通氧時間在60、80 s 時，測得的氮含量偏低，結(jié)果的RSD 較大，原因可能在于通氧時間不足，樣品沒有燃燒轉(zhuǎn)化完全，影響了氮含量的檢測結(jié)果。當通氧時間在100 s 以上時，測定結(jié)果理想，相對標準偏差較小，表明100 s 以上的通氧時間能滿足實驗對氧氣的需求，但通氧時間越長，氧氣剩余越多，過剩的氧氣會隨著進入還原管，氧化還原銅，從而降低其使用壽命。同時出于高效的考慮，最終選取100 s 的通氧時間最為合理。

2.4 優(yōu)化條件驗證試驗

通過影響條件的單因素實驗分析，建立得到杜馬斯定氮儀測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的最佳燃燒條件為：樣品稱樣量為200 mg，氧氣流量為200 mL/min，通氧時間為100 s。依據(jù)此優(yōu)化的燃燒條件參數(shù)，對樣品進行連續(xù)氮含量分析，結(jié)果如表4 所示。

表4 驗證試驗結(jié)果

為了進一步驗證此優(yōu)化條件的準確性，分別以標準物質(zhì)天（門）冬氨酸質(zhì)量與奶粉質(zhì)量比為1∶1、1∶3 的比例（基于燃燒法分析時，稱樣量少，稱量難度大，可考慮先將樣品與標準物質(zhì)混勻后取樣）進行加標回收試驗分析，實驗結(jié)果如表5 所示。

表5 加標回收試驗結(jié)果（n=6）

2.5 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測定結(jié)果對比

作為檢測蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，凱氏定氮法因其高的靈敏度、好的準確性，一直是我國國家標準中檢測蛋白質(zhì)含量的仲裁法和新進檢測方法的比對標桿。為了進一步驗證優(yōu)化條件的可行性，分別采用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法對同一奶粉樣品進行氮含量測定，分析結(jié)果如表6 所示。

表6 凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定氮含量結(jié)果對比表

表6 結(jié)果顯示，優(yōu)化條件下杜馬斯燃燒法的測定結(jié)果普遍略高于凱氏定氮法，比值D/K 范圍為0.993～1.022、趨近于1，絕對差值為0.02。由此看來，2種方法對奶粉中蛋白質(zhì)含量的檢測結(jié)果差異不大。而優(yōu)化條件下的杜馬斯燃燒法檢驗結(jié)果的相對標準偏差小于凱氏定氮法，說明該法測定的穩(wěn)定性要優(yōu)于凱氏定氮法，原因可能在于杜馬斯燃燒法的操作步驟比凱氏定氮法簡化的多，由此降低了人為、儀器等各個方面帶來的誤差。

為了全面考察此優(yōu)化條件的杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法對檢測相同樣品的差異性，對檢測結(jié)果進行配對t 檢驗。配對t 檢驗結(jié)果P 值為0.194、大于0.05，說明2 種方法無統(tǒng)計學差異。綜上得出結(jié)論：優(yōu)化條件的杜馬斯燃燒法能夠滿足對奶粉中蛋白質(zhì)含量的檢測需求，方法適用性較好。

2.6 注意要點

用杜馬斯燃燒法檢測樣品中蛋白質(zhì)含量，由于分析樣品用量少，所以要求樣品有好的均勻性。對于奶粉樣品，其樣品屬性為粉末狀態(tài)，所以無需經(jīng)過研磨過篩處理。但需要注意，若樣品出現(xiàn)受潮結(jié)塊等現(xiàn)象，需要提前處理確保檢測樣品均勻、有代表性；同時為了減小天平和稱量帶來的誤差，對于相同樣品，建議平行測定3 次來確保測量結(jié)果的準確；制樣壓片時，要壓片緊實，保證錫箔紙內(nèi)空氣全部排出，樣品無外漏。

選用純度較高的標準品同時保證稱取量能滿足實驗穩(wěn)定準確的需求。每次進行樣品分析前，需要進行校正因子的測試，當連續(xù)測試30～40 個次樣品后，也應再進行一次校正，校正時至少測定3 次標樣，消除由于受不同環(huán)境條件（氣壓和溫度）的影響，造成儀器系統(tǒng)的微小偏差。

樣品進行測試前，做好對儀器運行狀態(tài)及儀器測試性能的檢查。首先檢查各填充管的測試次數(shù)，在連續(xù)進行1 000 次試驗后需要對還原管進行檢查、替換；連續(xù)進樣40～50 次后，需要對灰分坩堝進行清理；干燥管中干燥劑有7 成以上濕潤變藍色后，就需要更換新的氧化鎂干燥劑。其次，檢查操作氣體是否流通正常，通氣管路是否有堵塞、漏氣等情況。能夠正常進樣、分析的通氣條件為：計算機中壓力顯示0.12～0.125 MPa，二氧化碳流量顯示約650 mL/min，Deltap 約232。再就是各個溫度的檢查，當熱導檢測器溫度達到（60.00±0.01）℃、燃燒管溫度達到（960±0.01）℃、二級燃燒管溫度達到（800±0.01）℃、還原管溫度達到（815±0.01）℃時方可進行樣品中蛋白質(zhì)含量的測試。最后要看下空白值測試情況，保證儀器管路內(nèi)空氣燃燒完全（即TCD 的基線走平）后，再進行樣品氮含量分析。

定期對儀器進行清潔、維護，延長儀器使用年限。每次檢驗完成后，要先對儀器進行降溫再關掉儀器電源。定期對儀器進行檢查、保養(yǎng)，清潔進樣盤、鎳板、球閥、石英橋，及時清理、更換干燥劑、還原物質(zhì)、灰分管、密封圈等。

3 結(jié) 論

以奶粉為分析對象，通過一系列單因素試驗，建立了杜馬斯燃燒法測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的最佳測試條件：樣品稱樣量為200 mg，氧氣流量為200 mL/min，通氧時間為100 s。同時對優(yōu)化的測試條件進行驗證，精密度及回收率都能滿足實驗所需。將此優(yōu)化條件下的檢測方法與凱氏定氮法進行比較，對同一奶粉樣品進行蛋白質(zhì)含量測試結(jié)果分析，表明2 種檢測方法分析結(jié)果無差異性，并且該方法的精密度、準確度更高，同時具有樣品消耗少、測試時間短、實驗過程綠色環(huán)保的優(yōu)點。當進行大批量奶粉中蛋白質(zhì)含量分析時，此優(yōu)化條件下的杜馬斯燃燒法具有更加顯著的優(yōu)勢。但當樣品批數(shù)較少時，出于前期儀器調(diào)試及檢測成本等多方考慮，分析人員可酌情選用檢測方法。