酶法在不同乳制品乳果糖檢測中的應用研究

葉巧燕，常嶸，劉慧敏，郭洪俠，遲雪露，宮慧姝，鄭楠

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所農業(yè)農村部奶及奶制品質量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100193；2.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；3.甘州區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅 張掖 734000）

0 引 言

乳果糖(4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-fructose)又稱乳酮糖，是液態(tài)奶經熱加工后，乳糖在酪蛋白的游離氨基集團的催化條件下堿基異構化而形成的一種雙糖[1-3]。乳果糖不是天然存在于生乳中的，不同的加熱處理方式產生的乳果糖含量不同，乳果糖的含量與熱加工程度成正比[4]。因此，乳果糖可作為判斷液態(tài)奶熱加工方式的重要指標，評價巴氏殺菌乳、滅菌乳和乳粉的熱處理強度[5-8]，或用于鑒定復原乳[9]。

檢測乳果糖的方法主要有酶法、高效液相色譜法、離子色譜法等[10-11]，其中，酶法是基于酶促反應動力學原理，將牛奶經過β-D-半乳糖苷酶水解后產生半乳糖和果糖，通過測定產生的果糖來計算乳果糖含量[12]。因酶法具有準確、穩(wěn)定、檢出限低（4.2 mg/L）的優(yōu)點，在巴氏殺菌乳、滅菌乳及復原乳上具有廣泛應用，但是否適用于生乳、高溫殺菌乳、特色乳、特色乳粉、嬰幼兒配方粉等不同乳制品中乳果糖含量的測定需要進一步試驗驗證。因此，本研究使用酶法對特色乳、嬰幼兒配方粉等不同乳制品中乳果糖檢測的準確度和精密度進行試驗，驗證酶法在檢測不同乳制品中乳果糖的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碳酸氫鈉（NaHCO3)、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O)、亞鐵氰化鉀（K4[Fe(CN)6]·3H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、硫酸銨（(NH4)2SO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2HPO4）、硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 、辛醇（C8H18O），分析純，國藥集團化學試劑有限公司；三乙醇胺鹽酸鹽[N(CH2CH2OH)3HCl]，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；過氧化氫（H2O2，質量分數(shù)：30%），分析純，德國MERCK 公司；5’-腺苷三磷酸二鈉鹽（C10H14N5Na2O13P3）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（C21H26N7Na2O17P3），分析純，美國SIGMA 公司。

β-D-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）源自米曲霉（Aspergillus oryzae），活性≥8 U/mg；葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4）源自黑曲霉（Aspergillus niger），活性≥100 U/mg；過氧化氫酶（EC 1.11.1.6）源自牛肝臟（bovine liver），活性≥40 000 U/mg，protein 濃度≥14 mg protein/mL；己糖激酶（EC 2.7.1.1）/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（EC 1.1.1.49）源自面包酵母(Baker's Yeast)，活性≥170 U/mg；磷酸葡萄糖異構酶（EC 5.3.1.9）源自面包酵母(Baker's Yeast)，活性≥560 U/mg，protein 濃度為≥8.0 mg protein /mL；以上酶制劑均來自美國SIGMA 公司。

巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳、滅菌乳、復原乳、全脂乳粉、嬰幼兒配方粉（一段嬰幼兒配方粉、二段嬰幼兒配方粉，以下簡稱一段、二段）和特色乳制品滅菌羊奶、滅菌駝奶、滅菌水牛奶、滅菌牦牛奶、羊乳粉、駝乳粉、配方羊奶粉，市售。

U-3900 紫外分光光度計，日本HITACHI 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品檢測

1.2.1.1 沉淀蛋白

分別選取生乳、巴氏殺菌乳、滅菌羊奶、全脂乳粉等10 種不同乳制品，粉狀樣品用溫水10 倍復溶后使用。向120 mL 樣品瓶中依次加入樣品20 mL、蒸餾水20 mL、130 g/L 亞鐵氰化鉀溶液7 mL、168 g/L 硫酸鋅溶液7 mL 和pH7.5 磷酸鹽緩沖液A 26 mL 震蕩混勻后靜置10 min，過濾收集濾液。

1.2.1.2 水解乳糖、乳果糖

吸取5.00 mL 濾液置于10 mL 刻度試管中加入1 890 U/mLβ-D-半乳糖苷酶溶液200 μL 混合均勻后加蓋，將其放入50 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1 h，同時做空白試驗，空白試液中不加β-D-半乳糖苷酶溶液。

1.2.1.3 葡萄糖氧化

在水解后的試液中依次加入2 mL pH7.5 三乙醇胺鹽酸鹽-硫酸鎂緩沖液C 4 000 U/mL 葡萄糖氧化酶溶液100 μL、辛醇1 滴、0.33 mol/L 氫氧化鈉溶液0.5 mL 和過氧化氫50 μL、1 300 000 U/mL 過氧化氫酶懸浮液50 μL。每加入一種試劑后都充分混勻，隨后將樣品放入40 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結束后放入室溫冷卻后用水定容至10 mL，過濾收集濾液。

1.2.1.4 測定

在比色皿中依次加入pH7.6 三乙醇胺鹽酸鹽-硫酸鎂緩沖液B 1.00 mL、50 g/L ATP 溶液0.10 mL、10 g/L NADP 溶液0.10 mL、濾液（1.2.1.3）1.00 mL、水1.00 mL，混合均勻后，靜置3 min，加入280 U/mL 己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶懸浮液20 μL，混合均勻，反應5 min 后，置于分光光度計上340 nm 處進行測定，記錄吸光值As1。繼續(xù)加入700 U/mL 磷酸葡萄糖異構酶懸浮液20 μL，混合均勻，反應5 min 后，記錄吸光值As2。

1.2.2 試驗設計

1.2.2.1 準確度試驗

分別對生牛乳、高溫殺菌牛乳等4 種液態(tài)乳，及全脂乳粉、嬰幼兒配方粉等5 種乳粉進行加標回收率試驗，選3 個不同水平的加標量，計算回收率和相對標準偏差，據(jù)此得到試驗的準確度。

1.2.2.2 精密度試驗

分別對生牛乳、高溫殺菌牛乳等4 種液態(tài)乳，及全脂乳粉、嬰幼兒配方粉等5 種乳粉進行精密度試驗，每個樣品重復測定6 次，計算平均值和相對標準偏差，據(jù)此得到試驗的精密度。

1.2.2.3 實際樣品應用

采用酶法對巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳、滅菌乳、特色乳、乳粉、配方粉和特色乳粉等118 批次實際樣品中的乳果糖含量進行測定，驗證該方法的實際應用效果。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行計算分析。

2 結果與分析

2.1 不同類型乳制品中的乳果糖檢測方法學驗證

2.1.1 準確度試驗

本試驗對生牛乳、高溫殺菌牛乳、滅菌羊乳、滅菌駱駝乳4 種液態(tài)乳進行加標回收率試驗，根據(jù)每個樣品的本底含量在其基礎上分別進行高、中、低3 個濃度水平的加標，每個濃度水平進行5 個平行樣品測定，計算平均回收率和相對標準偏差，結果如表1。樣品加標回收率為94.3%～108.4%、相對標準偏差（RSD）為0.1%～13.4%，符合方法學驗證的要求。表明酶法檢測生牛乳、高溫殺菌牛乳、羊乳、駱駝乳中乳果糖的準確度高。

本試驗對全脂乳粉、嬰幼兒配方粉、羊乳粉、駝乳粉、羊乳配方粉5 種乳粉及配方粉進行加標回收率試驗，根據(jù)每個樣品的本底含量在其基礎上分別進行高、中、低3 個濃度水平的加標，每個濃度水平進行5個平行樣品測定，計算平均回收率和相對標準偏差，結果如表2。樣品加標回收率為93.7%～109.7%、相對標準偏差（RSD）為0.1%～6.3%，符合方法學驗證的要求。表明酶法檢測全脂乳粉、嬰幼兒配方粉、羊乳粉、駝乳粉、羊乳配方粉中乳果糖的準確度高。

表2 乳粉樣品試驗結果 mg/kg

2.1.2 精密度試驗

本試驗分別選取生牛乳、高溫殺菌牛乳、羊乳、駱駝乳4 種液態(tài)乳進行精密度試驗，每個樣品重復測定6 次，計算平均值和相對標準偏差，結果如表3 所示。含量范圍處于檢出限水平的生乳樣品的相對標準偏差較大（13.9%）。高溫殺菌牛乳、羊乳、駱駝乳樣品中乳果糖檢測的RSD 為1.3%～4.0%，精密度符合方法學驗證要求，表明酶法用于檢測生牛乳、高溫殺菌牛乳、羊乳、駱駝乳中的乳果糖具有較好的精密度。

表3 液態(tài)樣品試驗結果 mg/L

本試驗分別選取全脂乳粉、嬰幼兒配方粉、羊乳粉、駝乳粉、羊乳配方粉5 種乳粉進行精密度試驗，每個樣品重復測定6 次，計算平均值和相對標準偏差，結果如表4 所示。樣品檢測RSD 為1.1%～6.3%，符合方法學驗證的要求。表明酶法檢測全脂乳粉、嬰幼兒配方粉、羊乳粉、駝乳粉、羊乳配方粉的精密度高。

表4 乳粉樣品試驗結果 mg/kg

2.2 實際樣品應用

從市場上隨機選取不同品牌規(guī)格的118 批次巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳、滅菌乳、特色乳、乳粉、配方粉和特色乳粉的實際樣品進行試驗。檢測結果如圖1 所示，不同類型乳制品中乳果糖的平均值從低到高依次為：巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳、乳粉、滅菌乳、特色乳、特色乳粉、配方粉，其中滅菌乳中乳果糖的含量顯著高于巴氏殺菌乳，結果與其他研究結果一致[13]。巴氏殺菌乳、滅菌乳的加工溫度分別為72～85 ℃、135～150 ℃，表明隨著熱加工溫度的變化，乳果糖含量也會發(fā)生變化。特色乳、特色乳粉中乳果糖含量差異較大且偏高，說明特色乳及特色乳粉在生產加工過程中可能存在過熱現(xiàn)象，加工工藝沒有標準化。嬰幼兒配方粉的乳果糖含量高于全脂乳粉，一方面是因為配方粉中添加了較多食品添加劑和營養(yǎng)強化劑，導致本底含量高。另一方面是因為在嬰幼兒配方粉生產過程中經歷的熱處理比全脂乳粉更強烈[14]。

圖1 不同類型乳制品乳果糖含量范圍

3 結 論

本試驗使用酶法對不同乳制品中乳果糖檢測的準確度和精密度進行試驗，結果顯示酶法同樣適用于生牛乳、高溫殺菌乳、特色乳、乳粉和配方乳粉等乳制品中乳果糖的測定，且不同乳制品中乳果糖的含量有較大差異，其中特色乳及特色乳粉中乳果糖含量較高、說明特色乳及特色乳粉可能存在過熱加工現(xiàn)象。綜上所述，本試驗拓寬了酶法測定乳制品中乳果糖的適用范圍，為高溫殺菌乳、特色乳、乳粉及嬰幼兒配方粉的加工工藝評價提供了依據(jù)，也為制訂乳果糖檢測標準提供了數(shù)據(jù)支撐。