基于TMT 技術(shù)對關(guān)中奶山羊初乳與成熟乳蛋白質(zhì)組學(xué)研究

陳璐，余夢琦，袁宇欣，屈穎新，任新陽，沙日阿康，李廣

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院奶羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

0 引 言

羊奶含有多種營養(yǎng)成分，其乳蛋白主要由70%酪蛋白 (CN)[1]、25%乳清蛋白 (WP) 和5%乳脂肪球膜(MFGM)蛋白組成[2]。盡管全球約84%的奶由奶牛生產(chǎn)提供，但其他動(dòng)物奶，如山羊奶仍對人們的生活和營養(yǎng)做出了極大貢獻(xiàn)，尤其是在貧困地區(qū)，山羊養(yǎng)殖承擔(dān)著幫助貧困人口脫貧致富和提供營養(yǎng)食品的重要作用。中國關(guān)中地區(qū)是關(guān)中奶山羊的主要生產(chǎn)區(qū)，其奶山羊飼養(yǎng)量達(dá)到240 余萬只，年產(chǎn)奶量達(dá)到144 萬t。因此山羊奶被認(rèn)為是中國人飲食中不可或缺的重要組成部分[3]。詹姆斯等[4]報(bào)道羊奶中的5 種主要蛋白質(zhì)(αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白)非常類似于牛奶蛋白，其中αS1-酪蛋白被認(rèn)為在牛奶過敏中起作用。至此，學(xué)者開始對山羊奶進(jìn)行相關(guān)蛋白組學(xué)研究，確定山羊乳蛋白多態(tài)性的特征[5]。

目前，隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)飛速發(fā)展，采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）標(biāo)記蛋白組學(xué)已經(jīng)成為一種探索動(dòng)物生長發(fā)育、疾病發(fā)生等生物學(xué)過程的重要技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)性狀調(diào)控機(jī)制研究中[6]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以比較不同品種的乳蛋白或者對相關(guān)蛋白質(zhì)定性定量分析，以往蛋白組學(xué)研究主要集中在對牛奶蛋白質(zhì)定性定量或者不同品種的乳蛋白上，然而對關(guān)中奶山羊羊奶不同泌乳階段的蛋白質(zhì)組學(xué)分析尚無研究報(bào)道[7-8]。為此，本研究采用基于TMT技術(shù)旨在探究關(guān)中奶山羊初乳與成熟乳蛋白質(zhì)組學(xué)差異，對不同泌乳階段的山羊乳蛋白成分和變化進(jìn)行識(shí)別和分析。以探究關(guān)中奶山羊羊奶對特定人群的營養(yǎng)意義，為進(jìn)一步探究特定功能乳產(chǎn)品配方的差異化研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)動(dòng)物均來自于隴縣和氏羊場。樣本采集嚴(yán)格按照中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與利用標(biāo)準(zhǔn)，所有的操作均被西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。試驗(yàn)于2021 年10 月至2022 年6 月進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

從陜西隴縣和氏高寒川乳業(yè)有限公司挑選相同環(huán)境下、體格健壯，日均產(chǎn)奶量（3.2±0.15）kg/d 的關(guān)中奶山羊18 只，采集初乳為2 d（A 組）和成熟乳為60 d（B組）的乳液，每組9 只羊，每3 只羊奶樣混勻?yàn)榛旌先?，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。采奶時(shí)間分別為早7 點(diǎn)和晚18點(diǎn)各一次，試驗(yàn)羊飼養(yǎng)管理采用常規(guī)飼喂管理方法，日均采食量為（3.00±0.5）kg/d。

1.1.1 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

Q Exactive HF、EASY-nLC 1200 液相，Thermo Fisher；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀；SDS-PAGE 凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；酶標(biāo)儀，上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；恒溫混勻儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；eStain LG 蛋白染色儀，南京金斯瑞生物科技有限公司；高pH 分離液相色譜儀，Agilent。

TMTpro 16 標(biāo)記試劑盒，ThermoFisher；BCA 試劑盒、質(zhì)譜級(jí)水、乙腈、甲酸、未染色蛋白分子量marker，ThermoScientific；預(yù)制膠，金斯瑞；DTT、甘油、溴酚藍(lán)、IAA，生工；胰酶，華利世；TEAB，Sigma；無水乙醇、異丙醇，GENERAL-REAGENT。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本前處理

將冷凍的樣品取出200 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中。加入丙酮沉淀蛋白后-40 ℃放置過夜。4 °C 下離心，收集沉淀。常溫下干燥后溶解于樣品裂解液中。再離心10 min,取上清，再次離心取上清。上清即為樣品的總蛋白溶液，進(jìn)行蛋白濃度測定并分裝后儲(chǔ)存于-80 °C 備用。向凍干樣品中加入50 μL 100 mmol/L TEAB 緩沖液，渦流混勻，于1.5 mL Ep 管中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。將冷藏后的TMT 試劑平衡到室溫，加入88 μL無水乙腈，渦流5 min，離心。取41 μL TMT 試劑加到樣品中，渦流混勻，室溫放置1 h。加入8 μL 5%羥胺終止反應(yīng)15 min，凍干后于-80 °C 保存。

1.2.2 樣本液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析

色譜條件：樣品以300 nL/min 的流速上樣到預(yù)柱Acclaim PepMap 100 μm×2 cm (RP-C18，Thermo Fisher)，再經(jīng)分析柱Acclaim PepMap RSLC, 75 μm×50 cm (RP-C18，Thermo Fisher)分離。

質(zhì)譜條件：一級(jí)MS 質(zhì)量分辨率設(shè)為60 000，自動(dòng)增益控制值設(shè)為3×106，最大注射時(shí)間為50 ms；質(zhì)譜掃描設(shè)定為全掃描荷質(zhì)比m/z 范圍350～1 500，并對其中20 個(gè)最高峰進(jìn)行MS/MS 掃描[9]；所有MS/MS 圖譜采集使用數(shù)據(jù)依賴型的正離子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量設(shè)為32；MS/MS 的分辨率設(shè)為45 000，自動(dòng)增益控制設(shè)為2×105，離子最大注射時(shí)間為80 ms；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為30 s。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Proteome Discover 2.4（Thermofisher公司）分析，利用數(shù)據(jù)庫檢索得到原始數(shù)據(jù)后，按照Score Sequest HT＞0 且unique peptide≥1，并去除空白值的標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白。對可信蛋白結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并可視化；得到可信蛋白后經(jīng)T-test 檢驗(yàn)表現(xiàn)差異蛋白，差異篩選條件：Foldchange＞1.2 且P＜0.05；得到差異表達(dá)蛋白之后，對差異蛋白進(jìn)行GO 富集分析，對其功能進(jìn)行描述。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行Pathway 分析（結(jié)合KEGG 注釋結(jié)果），用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)Pathway 條目中差異蛋白富集的顯著性并用P 值來表示，找出潛在富集通路途徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCA 分析

由圖1 可見，第一主成分（PC1） 的貢獻(xiàn)率是37.95%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率是33.22%，2 組總貢獻(xiàn)率是71.17%，從整體上能夠反映2 組樣本之間的代謝差異。從第一主成分方向看，A 組在第一主成分正軸上，B 組在第一主成分負(fù)軸上，從第二主成分方向看，B 組樣本基本在中心線附近，A 組中2 個(gè)樣本位于正半軸，一個(gè)樣本位于負(fù)半軸，在PC2 表現(xiàn)出組間顯著差異，在PC1 表現(xiàn)出組內(nèi)聚集，說明2 組樣本的差異主要體現(xiàn)在第二主成分上。樣本在95%的置信區(qū)間內(nèi)，且組間分離程度良好，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ头€(wěn)健可靠。

2.2 差異蛋白物篩選與鑒定

根據(jù)Foldchange（FC）≥1.2 且P＜0.05，共篩選出241 個(gè)差異蛋白，其中80 個(gè)蛋白顯著上調(diào)，161 個(gè)蛋白顯著下調(diào)，如圖2 所示。根據(jù)差異蛋白的FC 值大小，由大到小排列，顯著上調(diào)蛋白和顯著下調(diào)蛋白排名前15 的差異蛋白詳細(xì)見表1 與表2。其中顯著性上調(diào)蛋白中HPX（血紅素結(jié)合蛋白）、THBS1（血小板反應(yīng)蛋白）、CRP（c 反應(yīng)蛋白）、MGP（基質(zhì)Gla 蛋白）顯著表達(dá)。HPX 具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞和基因表達(dá)及促血管生成等作用[10]。研究表明，THBS1 在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，異常的DNA 甲基化是調(diào)節(jié)THBS1 的機(jī)制之一，是一種新的急性髓系白血病血清預(yù)后因子，是AML 患者治療的潛在治療靶點(diǎn)，CRP 是炎癥生物標(biāo)志物，同時(shí)是與衰老相關(guān)疾病的重要影響因素。最近的研究表明，CRP 在多種疾?。ǜ哐獕盒难芎湍I臟并發(fā)癥，糖尿病性腎病以及急慢性腎臟疾病）中具有致病性[11]。MGP 是維生素K 依賴性蛋白，在骨骼和許多其他間充質(zhì)細(xì)胞中合成，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）和軟骨細(xì)胞也高度表達(dá)該蛋白，MGP 是一種良好的鈣化抑制劑[12]。MGP 蛋白的表達(dá)有可能成為預(yù)測血管鈣化（VC）進(jìn)展的基因組生物標(biāo)志物。顯著性下調(diào)蛋白中LALBA、STOM 和GNB2 顯著表達(dá)，LALBA（乳清蛋白）能夠通過將半乳糖部分轉(zhuǎn)化為葡萄糖來產(chǎn)生乳糖，具有強(qiáng)烈結(jié)合鈣、鋅離子、殺菌及抗腫瘤活性，LALBA 的折疊變體HAMLET[13]，具有誘導(dǎo)腫瘤和未成熟細(xì)胞的凋亡的作用。STOM（氣孔蛋白）編碼的蛋白質(zhì)定位于紅細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的細(xì)胞膜，可以調(diào)節(jié)離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，STOM 定位缺失與遺傳性口腔細(xì)胞增多癥有關(guān)[14]。GNB2 表達(dá)降低可降低腫瘤細(xì)胞的增殖，其不同類型的突變可以激活許多規(guī)范的信號(hào)通路，并在包括急性髓性白血病和黑色素瘤在內(nèi)的幾種癌癥類型中賦予對靶向激酶抑制劑的抗性[15]。

表1 顯示上調(diào)的差異蛋白含量排名前15

表2 顯示下調(diào)的差異蛋白含量排名前15

圖2 關(guān)中奶山羊初乳組（A 組）和成熟乳（B 組）的差異蛋白

2.3 GO 富集分析

為了進(jìn)一步分析A 組與B 組中差異蛋白的生物學(xué)意義，對其進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果顯示如圖3，GO 條目被分為生物學(xué)過程（biologlcal process, BP）、細(xì)胞組成（cellular component, CC） 和分子功能[16]（molecular function, MF）3 個(gè)部分，其中差異表達(dá)蛋白主要富集在Acute-phase response（急性期反應(yīng)）、Lactose biosynthetic process（乳糖生物合成過程）、Ro protein signal transduction（Ro 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）、Extracellular region（細(xì)胞外分區(qū)）、Extracellular space（細(xì)胞外隙）、Golgi apparatus （高爾基體）、GTPase activity（GTP 酶活性）、GTP binding（GTP 結(jié)合）等8 個(gè)類別方面。

圖3 關(guān)中奶山羊初乳組（A 組）和成熟乳（B 組）的差異蛋白GO 功能富集

2.4 KEGG 通路富集分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行Pathway 分析（結(jié)合KEGG 注釋結(jié)果），按照每個(gè)條目對應(yīng)的P值由大到小排序，前20 條潛在通路顯示如圖4。A 組和B 組的差異蛋白富集數(shù)目由大到小排列前5 條潛在通路依次是Ras 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、補(bǔ)體通路、Rap1 信號(hào)通路和PPAR 信號(hào)通路。其中Ras信號(hào)通路中富集差異蛋白最為顯著，研究表明，Ras 信號(hào)通路與GTP 的合成與分解密切相關(guān)[17]。Ras 蛋白也是GTPase 開關(guān)蛋白，活性狀態(tài)對細(xì)胞的生長、分化、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和分泌等都具有影響。研究表明，癌細(xì)胞增殖時(shí)常利用活躍的Ras 通路[18]，將Ras 進(jìn)行突變，使得GAP 無法水解Ras 中的GTP[19]，在沒有GAP 幫助的情況下，GTP 水解時(shí)間會(huì)拉長，這意味著Ras 和GTP 相連的時(shí)間也會(huì)拉長，而Ras 將持續(xù)處于活躍狀態(tài)中，不斷地刺激下游通路，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖[20]。在Ras 信號(hào)通路中，Ras、Rab5、Rho 差異蛋白顯著下調(diào)，為探究其中關(guān)鍵因子抑制原癌基因表達(dá)提供新的思路和見解[21]。趨化因子是一個(gè)趨化蛋白大家族，在發(fā)育、體內(nèi)平衡和炎癥過程中控制白細(xì)胞遷移中起重要作用[22]。趨化因子信號(hào)通路傳導(dǎo)始于配體-受體結(jié)合和通過GDP/GTP 交換激活受體相關(guān)的異源三聚體Gi 型G 蛋白[23]，導(dǎo)致Gα-1 和Gβ-γ 亞單位的解離。Gβ-γ 亞單位激活1BPI 3-激酶和PLC-β(PLC)。1B PI 3-激酶類，由p101 調(diào)節(jié)亞單位和p110 催化亞單位組成，隨后磷酸化并激活多種底物，包括Itk 和Akt，調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞存活、細(xì)胞生長和增殖。同時(shí)，PLC 水解PIP2 產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)，分別觸發(fā)鈣動(dòng)員和蛋白激酶C (PKC)激活。PKC 的激活導(dǎo)致IKK 的磷酸化，然后磷酸化IκB，促進(jìn)其泛素依賴性蛋白酶體降解，并允許NF-κB 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核并誘導(dǎo)基因表達(dá)。PKC 還磷酸化黏著斑激酶(FAK)和富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)，2 種非受體蛋白酪氨酸激酶[24]。這2 種激酶磷酸化底物，如p130Cas 和樁蛋白，以促進(jìn)黏著斑形成和分解、細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移。在Gβ-γ 亞單位激活這些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的同時(shí)，解離的G 蛋白的Gα1-GTP 結(jié)合亞單位抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低細(xì)胞內(nèi)cAMP，并刺激Src 的激酶活性。Src 隨后磷酸化多個(gè)下游底物，包括IA 類PI3-激酶、Itk、FAK、PYK2、ELMO-1 和Shc，Itk、FAK 和PYK2 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組和黏著斑形成[25]，Src 磷酸化ELMO-1 激活信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)所需的細(xì)胞骨架重組。此外，Src依賴的Shc 磷酸化導(dǎo)致GRB2-SOS 復(fù)合物的募集和Ras-MAPK 信號(hào)通路的激活，后者介導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖和遷移。趨化因子信號(hào)通路不僅可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞組成，還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移參與調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫。因此，趨化因子通路中的蛋白質(zhì)可以作為治療癌癥和炎性疾病的治療靶點(diǎn)，待進(jìn)一步研究。

圖4 關(guān)中奶山羊初乳組（A 組）和成熟乳（B 組）差異蛋白KEGG 通路功能富集

3 結(jié) 論

通過對山羊初乳和成熟乳進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，共篩選出241 個(gè)差異蛋白，其中80 個(gè)蛋白顯著上調(diào)，161個(gè)蛋白顯著下調(diào)。通過GO 富集分析，差異表達(dá)蛋白主要富集在Acute-phase response（急性期反應(yīng)）、Lactose biosynthetic process（乳糖生物合成過程）、Ro protein signal transduction（Ro 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）、Extracellular region（細(xì)胞外分區(qū)）、Extracellular space（細(xì)胞外隙）、GTPase activity（GTP 酶活性）、GTP binding（GTP結(jié)合）等8 個(gè)類別方面。KEGG 通路富集分析顯示差異最顯著的蛋白富集在Ras 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、補(bǔ)體通路、Rap1 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路。研究結(jié)果揭示了山羊在不同泌乳期營養(yǎng)價(jià)值，確定了關(guān)中奶山羊羊奶對特定人群的營養(yǎng)意義以及在中國和其他地區(qū)山羊奶生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)影響，為預(yù)防癌癥等特定功能化乳品的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。