新國標(biāo)下嬰幼兒配方奶粉與中國母乳脂質(zhì)組分的比較研究

景紅申，尉騰，張芷怡，黃鈺琪，鄧澤元，李靜

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047）

0 引 言

母乳是嬰幼兒最好的營養(yǎng)來源，具有調(diào)節(jié)腸胃功能、免疫功能和促進(jìn)大腦發(fā)育等活性功能。由于多方面因素影響，純母乳喂養(yǎng)的比例不高，嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒營養(yǎng)攝入的重要來源[1]。目前，嬰幼兒配方奶粉模擬母乳中成分，以期達(dá)到與之接近的生物活性。脂質(zhì)是母乳中重要組分，與乳糖、蛋白質(zhì)共同組成母乳中三大營養(yǎng)素。脂質(zhì)主要包括甘油三酯、磷脂、固醇類物質(zhì)以及極少量的游離脂肪酸，其中甘油三酯占比為98%以上[2]。脂質(zhì)分為脂肪和類脂兩類，脂肪即甘油三酯為哺乳動物主要的能量來源，類脂則主要構(gòu)成細(xì)胞膜等組織，促進(jìn)脂質(zhì)的代謝循環(huán)。

甘油三酯是脂質(zhì)的主要組成部分，由一分子甘油和三分子脂肪酸酯化生成。嬰幼兒配方奶粉通過混合不同來源的油脂，如植物油等，可實(shí)現(xiàn)與母乳在脂肪酸層面上一致[3]。但母乳的脂質(zhì)吸收率仍高于嬰幼兒配方奶粉，原因是兩者甘油三酯的構(gòu)型不同。母乳中棕櫚酸（C16∶0）通常酯化在甘油三酯的Sn-2，在嬰幼兒體內(nèi)分解為棕櫚酸單甘酯，從而更易被消化吸收[4]。嬰幼兒配方奶粉中棕櫚酸在Sn-2 的酯化率低于母乳，因此通常在體內(nèi)分解為單獨(dú)的棕櫚酸，會影響到嬰幼兒對脂質(zhì)的利用[5]。

母乳中磷脂屬于極性脂質(zhì)，分為甘油磷脂和鞘磷脂（sphingomyelin，SM），甘油磷脂主要為磷脂酰膽堿（phosphatidyl-choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl -ethanolamine，PE）、 磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）。母乳乳脂肪球膜中磷脂占比為60%～65%，PC和SM 主要位于外部雙分子層膜的外層，PE 主要位于其內(nèi)層，而連接內(nèi)部甘油三酯的內(nèi)部單層膜中磷脂主要為PI 和PS[6]。嬰幼兒配方奶粉中磷脂來源牛羊乳和乳脂肪球膜蛋白，添加磷脂的嬰幼兒配方奶粉有利于新生兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和提高免疫力[7]。膽固醇對嬰幼兒的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用，尤其是對于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。膽固醇為維生素D 和激素等活性物質(zhì)前體，對維持體內(nèi)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)尤為重要[8]。

隨著嬰幼兒配方奶粉高質(zhì)量發(fā)展，嬰幼兒配方奶粉新國標(biāo)出臺。本研究從脂肪酸組成、甘油三酯構(gòu)型、磷脂含量與組成、膽固醇含量的角度上，比較新國標(biāo)不同階段嬰幼兒配方奶粉與母乳脂質(zhì)的異同，旨在從脂質(zhì)角度為嬰幼兒配方奶粉母乳化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新國標(biāo)不同階段嬰幼兒配方奶粉由乳品企業(yè)提供，分別為嬰兒配方奶粉（IF1，2 個品牌），較大嬰兒配方奶粉（IF2，2 個品牌）和幼兒配方奶粉（IF3，2 個品牌）。

母乳樣品由中南大學(xué)提供，為5 個江西興國，5個湖南瀏陽，5 個湖南懷化健康孕母的成熟乳樣混合而成。

脂肪酸GLC463 標(biāo)樣，美國NuChek Prep 公司；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁試劑有限公司；磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，加拿大TRC 公司；正己烷、乙腈、異丙醇、甲醇，色譜純；德國默克股份有限公司。其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140 分析電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；QL-861 型渦流振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TDL-5-A 臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DSY-V1 型水浴氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司；HP1100 高效液相色譜儀、6890N 型氣相色譜儀、1290 超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 母乳與嬰幼兒配方奶粉中粗脂的提取

奶粉的溶解參照李靜等[9]的方法，取1 g 奶粉，按奶粉∶水=1∶7 的比例在60 ℃水浴中溶解。粗脂的提取參照FOLCH J[10]法并加以調(diào)整，取溶解后的奶粉或母乳1 mL，加入10 mL 二氯甲烷∶甲醇（V二氯甲烷∶V甲醇=2∶1）混合溶液，1.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，渦流1 min，4 000 r/min 離心10 min。取下層二氯甲烷有機(jī)相于玻璃管中，加入10 mL 二氯甲烷：甲醇溶液，渦流后離心。收集2 次的二氯甲烷有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，用適量氯仿溶于棕色玻璃瓶，貯存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 總脂肪酸分析

甲酯化方法參照翁晨等[11]，將2 mL 的粗脂溶于1.5 mL 正己烷，依次加入40 μL 乙酸甲酯和100 μL甲醇鈉溶液，渦流1 min，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，取出放于-20 ℃冰箱中冰凍10 min，取出加入60 μL 草酸-乙酸乙酯溶液終止反應(yīng)，離心取上清，氮?dú)獯蹈?，? mL 色譜級正己烷復(fù)溶。氣相色譜儀分析脂肪酸組成與含量。含量以峰值面積的百分比表示。

1.3.3 甘油三酯組成分析

1.3.3.1 樣品制備

取適量的粗脂，用色譜級氯仿∶甲醇=2∶1 將其稀釋至5 mg/mL，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，待測。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18，2.1 × 50 mm 1.8 Micron；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流動相流速0.2 mL/min；流動相A 為含10 mmol/L 甲酸銨的乙腈-異丙醇（V乙腈∶V異丙醇=1∶9）溶液；流動相B 為含10 mmol/L 甲酸銨的乙腈-水（V乙腈∶V水=4∶6）溶液；洗脫梯度為0 min：70%A；1 min：70% A；31 min：87%A；33 min：70%A；37 min：70%A[12]。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

Dual AJS ESI 離子源，正離子掃描模式；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速8 L/min；霧化器壓力137 900 Pa；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；噴嘴電壓30 V；碰撞氣體為氮?dú)?，一級碰撞電? V，二級碰撞電壓20～40 V；相對分子質(zhì)量掃描范圍（m/z）40～1 700。

1.3.4 磷脂分子組成測定

1.3.4.1 樣品制備

稱取40 mg 粗脂，加入600 μL 色譜級氯仿溶解，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，待測。

1.3.4.2 磷脂組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取50 mg PI、PE、PS、PC 和SM 5 種磷脂組分標(biāo)品，用色譜級氯仿定容到50 mL 的容量瓶中，制備成1.0 g/L 儲備液。分別取0.2、0.6、1、2、4、6 mL 的儲備液置于10 mL 容量瓶，用色譜級氯仿定容，配制成0.02、0.06、0.1、0.2、0.4、0.6 g/L 磷脂標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，液相色譜蒸發(fā)光檢測器分析。以單一磷脂組分濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制5種磷脂組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 色譜條件

參照文獻(xiàn)[13]，色譜柱為NUCLEOSIL 50-5 250 mm×4.6 mm；流動相A 為乙腈-甲醇（V乙腈∶V甲醇=100∶3），流動相B 為3 g/L 甲酸銨水溶液；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；蒸發(fā)光檢測器：evap 90 ℃；neb 40 ℃；N2流速1 L/min；增益為1；洗脫梯度為0 min：99%A；19 min：70%A；22 min：70%A；25 min：99%A。

1.3.5 膽固醇含量的測定

1.3.5.1 樣品制備

參照文獻(xiàn)[14]的方法，取1 mL 溶解后的奶粉或母乳，稱量計重，加入2 mL 2 mol/L 氫氧化鉀乙醇溶液，在80 ℃中皂化20 min，每隔5 min 振蕩試管，迅速取出并用冰水冷卻至室溫，加入3 mL 正己烷，搖勻后靜置，取上層有機(jī)相，加入3 mL 正己烷，重復(fù)萃取2 次，收集上層有機(jī)相于試管中，加入25 mL 水，取上層有機(jī)相過無水硫酸鈉，氮?dú)獯蹈桑?00 μL 色譜級乙腈復(fù)溶，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，待測。

1.3.5.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取100 mg 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 的容量瓶中，色譜級乙腈定容得到1.0 g/L 的儲備液。精密量取0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 儲備液，置于10 mL的容量瓶中，用色譜級乙腈定容，配制成0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.5.3 色譜條件

條件參照BAUER 等[15]，色譜柱采用安捷倫Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為純甲醇，柱溫設(shè)置為35 ℃，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長是205 nm。

1.3.6 相似度分析

相似度分析參考牛仙等[16]，計算嬰幼兒配方奶粉到標(biāo)準(zhǔn)值（母乳樣本）的馬氏距離，公式如下：

D2=（Ti-T）/M×（Ti-T）

式中：D 為馬氏距離；Ti為嬰幼兒配方奶粉的得分向量；T 為標(biāo)準(zhǔn)值；i 為樣本編號；M 為標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)集因子分析中得分陣的協(xié)方差陣。

相似性評分基于馬氏距離，轉(zhuǎn)化為正相關(guān)的得分值S，公式如下：

S=100-D2

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究利用Mass dial 4.16 軟件對甘油三酯的構(gòu)型進(jìn)行定性分析，甘油三酯數(shù)據(jù)采用MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件繪圖，采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用matlab 2020a 進(jìn)行主成分分析和馬氏距離評分，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 新國標(biāo)下不同階段嬰幼兒配方奶粉脂質(zhì)的比較

通過GC 分析，IF 和母乳中檢測到36 種脂肪酸,如表1 所示，母乳中SFA 含量為34.594%，顯著高于IF（31.642%～32.322%）；母乳中MUFA 含量為38.952%，顯著低于IF（42.368%～43.981%）；母乳與IF 中PUFA含量相近，為24.346%～26.454%。各個階段的IF 中SFA、MUFA 和PUFA 的含量無顯著差異。

表1 嬰幼兒配方奶粉與母乳中脂肪酸的組成及相對含量

續(xù)表

如表2 所示，嬰幼兒配方奶粉與母乳中甘油三酯種類共檢出50 種。中鏈甘油三酯(MCT)可快速提供能量，同時還具有抗炎、抗菌活性等[17-18]。在不同階段的IF 中，MCT 相對含量為18.034%～22.209%，IF1 中含量最低，IF2 中含量最高（22.209%）；母乳中MCT 含量較低（1.108%）。中長鏈甘油三酯(MLCT)是母乳中含量最豐富的甘油三酯種類，具有促進(jìn)脂類消化吸收，調(diào)節(jié)血脂等作用[19-21]。母乳中MLCT 含量高達(dá)46.142%，顯著高于IF（12.751%～13.824%）；其中母乳中長鏈甘油三酯（MLL）較豐富，如母乳中MLL 相對含量為37.268%，顯著高于IF（2.145%～2.275%），而母乳MML 相對含量為8.874%，遠(yuǎn)低于其在IF 中的含量（10.606%～11.549%）。在不同階段的配方奶粉中，長鏈甘油三酯(LCT)的相對含量為64.669%～67.596%，其中IF3 含量最低，為64.669%，而母乳中LCT 含量（52.751%）低于IF。

表2 嬰幼兒配方奶粉與母乳中甘油三酯的組成及相對含量

如表3 所示，IF 與母乳中磷脂主要為5 種，分別為PI、PE、PS、PC、SM。IF 中PE（0.097～0.134 g/100 g脂肪）和PC（0.075～0.108 g/100 g 脂肪）含量較高，而母乳中SM 含量最高（0.072 g/100 g 脂肪）。研究表明，PC 具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡、抑制肝炎等功能[22]，PE 具有降膽固醇作用[23]，而SM 是動物特有的磷脂具備抗炎以及促進(jìn)腸道發(fā)育的作用[24]。母乳中膽固醇含量（9.185 mg/100 mL 乳）遠(yuǎn)高于IF（1.653～3.161 mg/100 mL 乳），與KOLETZKO 等[25]研究結(jié)果一致。

表3 嬰幼兒配方奶粉與母乳中磷脂及膽固醇含量

通過對IF 與母乳中的脂質(zhì)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，如圖1 所示，PLS-DA 的第一主成分(PC1)的方差解釋率為60.2%，第二主成分(PC2)的方差解釋率為15.3%，其累計方差解釋率為75.5%，說明數(shù)據(jù)具有顯著變異性[26]。圖1 表明，不同階段IF 與母乳中的脂質(zhì)可明顯的區(qū)分，說明母乳與配方奶粉中脂質(zhì)存在顯著的差異，且不同階段IF 之間也存在差異。

圖1 嬰幼兒配方奶粉與母乳中脂質(zhì)組成的PLS-DA

變量投影重要性(Variable Importance in Projection,VIP) 反映在模型中自變量在解釋因變量時作用的重要性，VIP 值＞1 時，表明該變量對模型影響較大[27]。為分析具有更明顯差異的變量，選擇VIP＞1.4 的甘油三酯，如圖2 所示，MLL、MCT、C20∶3n-6、C7c16∶1、Cy/La/M、Cy/Ca/La、La/La/P、Ca/La/M、P/E/O、O/O/Eo、P/P/P、O/Ln/Ln、La/M/O、E/O/L、La/La/M、O/O/O、C9c16 ∶1和PE。母乳中MLL、E/O/L、OOO 的相對含量高于IF，可能原因是母乳中富含中長鏈甘油三酯，可加快脂質(zhì)的代謝速率，實(shí)現(xiàn)快速供能，提高嬰幼兒的機(jī)體免疫力[20]。IF 中MCT、Cy/La/M、Cy/Ca/La、La/La/P、Ca/La/M、P/E/O、O/O/Eo、P/P/P、O/Ln/Ln、La/M/O、La/La/M的相對含量高于母乳，其原因可能是IF 中鏈脂肪酸來源于椰子油等油脂，其脂肪酸與母乳脂肪酸相近[28]。

圖2 嬰幼兒配方奶粉與母乳中脂質(zhì)組成的VIP

2.2 嬰幼兒配方奶粉與新國標(biāo)脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的比較

IF 主要根據(jù)母乳中的脂肪酸種類和含量進(jìn)行優(yōu)化配方。新國標(biāo)不同階段IF 在脂肪酸層面進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化：IF1、IF2 和IF3 中亞油酸和α-亞麻酸的比值（LA/ALA）應(yīng)介于1∶5 和1∶15 之間。IF1 和IF2 中月桂酸和肉蔻酸總量（SUM (C12：0+C14：0)）≤總脂肪酸的20%、反式脂肪酸（TRANS）≤總脂肪酸的3%、芥酸（C22：1）≤總脂肪酸的1%，IF1 和IF2 可添加成分包括二十二碳六烯酸（DHA），若添加了DHA 至少要添加等量的二十碳四烯酸（AA）,且二十碳五烯酸（EPA）應(yīng)低于DHA 的量。IF3 中反式脂肪酸≤總脂肪酸的3%。如圖3 所示，IF1、IF2、IF3 中SUM(C12：0+C14：0)約5%，遠(yuǎn)低于20%；TRANS 含量約0.3%，低于3%；C22：1 含量約為0.05%，遠(yuǎn)低于1%；LA/ALA 約為1∶7；AA 的添加量高于DHA，且EPA 遠(yuǎn)低于DHA。綜上，IF1、IF2 和IF3 均符合且優(yōu)于新國標(biāo)脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 嬰幼兒配方奶粉和母乳與國標(biāo)GB10765-2021 中脂質(zhì)指標(biāo)的比較

2.3 新國標(biāo)嬰幼兒配方奶粉與母乳的相似性評價

基于甘油三酯、磷脂組成、膽固醇為考察指標(biāo)，建立嬰幼兒配方奶粉脂質(zhì)評價模型。如圖4（a）所示，基于馬氏距離的評分最高的是IF1（81.34%），其次為IF2（80.949%），最低的為IF3（80.826%）。評分越高，說明該配方粉與母乳脂質(zhì)越接近。結(jié)果表明，嬰幼兒配方奶粉與母乳脂質(zhì)的相似度評分可達(dá)80%，其中嬰兒配方奶粉脂質(zhì)更接近母乳。

圖4 嬰幼兒配方奶粉與母乳相似性評價

基于母乳中重要甘油三酯及脂肪酸（O/P/O、O/P/L、L/P/L、OA、PA、LA、ALA、ARA、EPA、DPA、DHA）為考察指標(biāo)，評價嬰幼兒配方奶粉中脂質(zhì)品質(zhì)。如圖4（b）所示，基于馬氏距離的評分最高的是IF2（95.212%），其次為IF1（93.695%），最低的為IF3（93.363%）。0～6 月齡嬰兒主要以母乳為主，隨著嬰兒的成長，6～12 月齡嬰兒奶粉的攝入量有所增加，而12～36 月齡的幼兒開始攝入更多營養(yǎng)均衡的輔食，奶粉的攝入量也會受到影響。因此IF2 的脂質(zhì)品質(zhì)更高會更有益于嬰兒的生長發(fā)育。

3 結(jié) 論

分析比較了母乳、嬰兒配方奶粉、較大嬰兒配方奶粉和幼兒配方奶粉的脂質(zhì)組成與含量，分析其是否符合新國標(biāo)中脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，剖析嬰幼兒配方奶粉與母乳的相似性以及影響因素。嬰幼兒配方奶粉中中鏈和長鏈甘油三酯含量高于母乳，而母乳中中長鏈甘油三酯含量遠(yuǎn)高于嬰幼兒配方奶粉。嬰幼兒配方奶粉中磷脂含量高于母乳，嬰幼兒配方奶粉中PE 與PC 含量最高，而母乳中SM 含量最高。母乳中膽固醇的含量高于嬰幼兒配方奶粉，其中嬰兒配方奶粉膽固醇含量高于其他階段的配方奶粉。不同階段嬰幼兒配方奶粉脂質(zhì)要求符合且優(yōu)于新國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且嬰幼兒配方奶粉在脂質(zhì)方面與母乳的相似性評分可達(dá)80%，脂質(zhì)品質(zhì)的相似性評分高于90%。