間苯三酚注射液細(xì)菌內(nèi)毒素法的研究

尚博揚(yáng)， 王 寧， 翟 宇

（1.寧夏衛(wèi)生健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石嘴山 753000； 2.寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，銀川 750002）

間苯三酚注射液具有緩解痙攣的作用，可用于緩解消化系統(tǒng)和膽道功能障礙引起的急性痙攣和疼痛，臨床應(yīng)用廣泛[1-2]。采用熱原法對(duì)間苯三酚注射液進(jìn)行安全性檢測(cè)，需將一定量的被測(cè)樣品通過(guò)靜脈注入家兔體內(nèi)，觀察其注射后3 h以內(nèi)體溫升高的情況，以判斷所測(cè)樣品中有無(wú)熱原存在。此方法有操作繁瑣、價(jià)格昂貴、重復(fù)性差、靈敏度較低、使用活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等缺點(diǎn)，且不滿足現(xiàn)在所提出的“3R”動(dòng)物福利原則，故已被細(xì)菌內(nèi)毒素法所代替。細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法是利用鱟試劑（TAL）檢測(cè)革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判定被檢測(cè)物質(zhì)是否符合規(guī)定的一種方法，此方法操作簡(jiǎn)便易行、靈敏度比家兔法高10 倍、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低、結(jié)果迅速可靠，能真實(shí)地模擬人體對(duì)熱原的反應(yīng)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用[3-4]。本研究擬參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版第四部收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對(duì)該品種替代熱原法進(jìn)行可行性研究。

1 材料與儀器

1.1 供試品及試劑

1.1.1 供試品 間苯三酚注射液（萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)有限公司；規(guī)格：4 mL∶40 mg；批號(hào)：3G2112023、3G211106A、3G211207A）。

1.1.2 TAL 2 批分別購(gòu)自福州新北生化工業(yè)有限公司（規(guī)格：0.1 mL/支，批號(hào)：22021812，靈敏度：0.25 EU·mL-1）和湛江博康海洋生物有限公司（規(guī)格：0.1 mL/支，批號(hào)：20220103，靈敏度：0.25 EU·mL-1）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（規(guī)格：90 EU/支，批號(hào)：150601-202191）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）分別購(gòu)自福州新北生化工業(yè)有限公司（規(guī)格：5 mL/支，批號(hào)：21010105，內(nèi)毒素含量：＜0.015 EU·mL-1）和湛江博康海洋生物有限公司（規(guī)格：5 mL/支，批號(hào)：2012020，內(nèi)毒素含量：＜0.003 EU·mL-1）。

1.2 儀器設(shè)備

ZH-2 自動(dòng)漩渦混懸器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TW200 電熱恒溫水浴鍋［優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司］；OMS60 電熱鼓風(fēng)干燥箱（美國(guó)Thermo Fisher 儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL 靈敏度的復(fù)核實(shí)驗(yàn)

取TAL 2 批（每批18 支）分別加入BET 水0.1 mL 溶解，另取CSE 1 支用BET 水溶解后制備成2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ，共4 個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與等體積的TAL 溶液混合，每一內(nèi)毒素濃度平行做4 支；另取2 支加入等體積的BET 水作為陰性對(duì)照（NC），依法檢查[3]并計(jì)算TAL 靈敏度測(cè)定值（λc）。計(jì)算結(jié)果表明，λc 均在0.5～2 λ，結(jié)果符合規(guī)定，均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，見表1。

表1 TAL 靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L=K/M 確定內(nèi)毒素限值，《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版第四部規(guī)定K 為靜脈用藥時(shí)為5 EU·（kg·h）-1，M 為人均體質(zhì)量按60 kg 計(jì)，該品種每日最大劑量為200 mg，故M=3.3 mg·kg-1；L=K/M=5 EU·（kg·h）-1÷3.3 mg·（kg·h）-1=1.5 EU·mg-1。間苯三酚注射液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）=C·L/λ=10×1.5/0.25=60 倍（C 為供試品規(guī)格；L 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；λ 為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度）[3]。

2.3 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)[3-5]

干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)是為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)，以避免實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的盲目性及造成試劑的浪費(fèi)。由于3 批樣品的pH 均在4.0 左右，偏酸性會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL 存在一定的干擾，先用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液將間苯三酚注射液pH 值調(diào)節(jié)在6.0～8.0，再用BET 水將供試品分別稀釋成20、30倍，以及最大稀釋倍數(shù)60 倍的溶液，每個(gè)濃度2支，標(biāo)記為供試品陰性對(duì)照（NPC）；用上述NPC作為稀釋液制備2 λ 的供試品溶液，每個(gè)濃度2支，標(biāo)記為供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）并NC 和細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照（PC），從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出間苯三酚注射液在30 倍稀釋時(shí)樣品對(duì)內(nèi)毒素與TAL 均無(wú)干擾作用，見表2。

表2 間苯三酚注射液干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 正式干擾實(shí)驗(yàn)

取TAL 共2 批，每批72 支，分別加BET 水0.1 mL 溶解，取調(diào)節(jié)至中性的間苯三酚注射液3批用BET 水稀釋30 倍[6]，另取CSE 1 支，分別用BET 水和30 倍稀釋液制成2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ的BET 水系列和供試液系列，每個(gè)濃度4 支；并設(shè)2 支BET 水作陰性對(duì)照，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版第四部通則要求依法檢查，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有NC 及BET 水系列溶液的結(jié)果均符合實(shí)驗(yàn)要求，表明本研究方法可行，根據(jù)結(jié)果計(jì)算用BET 水制成的CSE 的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）［Es=antilg（∑Xs/4）］，和用供試品稀釋液制成的CSE 的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）［Et=antilg（∑Xt/4）］均在規(guī)定范圍之內(nèi)，Xs、Xt 分別為用BET 水和供試品稀釋液制成的CSE 溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。由干擾實(shí)驗(yàn)可以看出，Es 值均為0.5～2.0 λ（包括0.5 λ和2 λ），0.5 Es≤Et 值≤2.0 Es 范圍，說(shuō)明將樣品稀釋成30 倍時(shí)樣品對(duì)TAL 及內(nèi)毒素?zé)o干擾作用，可在該濃度下對(duì)此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，見表3。

表3 間苯三酚注射液干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取TAL 共2 批，每批24支，分別對(duì)供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并同時(shí)設(shè)立其自身陽(yáng)性和陰性對(duì)照管。結(jié)果表明，間苯三酚注射液對(duì)TAL 均無(wú)干擾，重復(fù)性良好，結(jié)果均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版第四部規(guī)定的要求，見表4。

表4 內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

在進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)PPC 會(huì)出現(xiàn)無(wú)規(guī)律的陰性結(jié)果，而NC 和PC 結(jié)果均正常，經(jīng)過(guò)排查推測(cè)可能是由于間苯三酚注射液pH 值偏酸性造成的。因此，用適宜方法將本品的pH 值調(diào)節(jié)至7.0 且經(jīng)過(guò)30 倍稀釋時(shí)再進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)PPC 便沒(méi)有再發(fā)生陰性結(jié)果。

本品現(xiàn)有法定標(biāo)準(zhǔn)是采用熱原檢查法對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，但其方法操作繁瑣、靈敏度低、干擾因素多。為了降低藥品的安全風(fēng)險(xiǎn)，找到切實(shí)可行、簡(jiǎn)單易做的方法，使該產(chǎn)品目前使用的標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)謹(jǐn)[7]，本研究對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行探索性研究，考察細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法的可行性。研究結(jié)果表明，該品種對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法無(wú)干擾，此方法無(wú)論是特異性還是時(shí)效性都優(yōu)于熱原法，可替代熱原法進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。本研究表明，間苯三酚注射液用BET 水稀釋30 倍時(shí)，對(duì)靈敏度為0.25 EU·mL-1的TAL 無(wú)干擾作用，可用于原料及其制劑的質(zhì)量控制。本研究的方法只適用于萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的該產(chǎn)品，由于不同廠家的生產(chǎn)工藝不同，細(xì)菌內(nèi)毒素干擾因素也不一樣，因此對(duì)于不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的間苯三酚注射液，應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際情況，建立與其相適應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，確保所建立的方法準(zhǔn)確、合理，以便更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

4 結(jié)論

本研究中的TAL 靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合要求，而且用BET 水制成的CSE的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值Es 值在0.5～2.0 λ（包括0.5 λ 和2 λ）范圍、用供試品稀釋液制成的CSE 的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）在0.5～2.0 Es（包括0.5 Es 和2.0 Es）范圍內(nèi)。研究結(jié)果表明，本研究為該品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）的建立提供了參考依據(jù)；故將樣品稀釋成30倍時(shí)，選擇靈敏度為0.25 EU·mL-1的TAL 進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原法進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)可行，結(jié)果符合規(guī)定，可滿足安全需要，且生產(chǎn)廠家的工藝水平完全可以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，可避免一藥多項(xiàng)、一項(xiàng)多限的問(wèn)題。