不同居群北柴胡ISSR遺傳多樣性分析

閆曉睿，薛幗珍，楊曉霞，王宇，杜晨暉，張朔生，劉計權(quán)

山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619

中藥柴胡最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為“上品”，到目前為止已經(jīng)使用了兩千多年［1］。柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”［2］。柴胡具有解表和里、疏肝解郁、升提中氣之功效，主治感冒發(fā)熱、寒熱往來、黃疸肝炎及月經(jīng)不調(diào)等［3］。其中，北柴胡主要產(chǎn)自山西、河北、河南、遼寧等省份，而南柴胡主要產(chǎn)于湖北、四川、安徽等省份。根據(jù)相關(guān)資料顯示，全世界柴胡屬植物大約有200種，我國現(xiàn)已明確的柴胡屬植物共有42個種、17個變種和7個變型［4-6］。除海南省外，柴胡在我國其他省份都有分布［7］。柴胡種源豐富，在一定程度上給鑒別工作帶來了不小難度。

自古以來，山西省都是道地藥材柴胡的重要產(chǎn)地之一，省內(nèi)南北地理較大的跨度導(dǎo)致柴胡在不同的地理位置、氣候、水土等條件影響下的內(nèi)在質(zhì)量和外觀性狀良莠不齊。因此，對不同來源柴胡的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系進(jìn)行分析具有重要意義?，F(xiàn)階段對柴胡真?zhèn)舞b別的方法有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）、內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）片段及ISSR分子標(biāo)記等［8］。本研究采取液氮研磨提取法，提取了10 個不同居群的北柴胡DNA，對其ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并研究了10個居群的北柴胡樣品的種內(nèi)親緣關(guān)系，以期為胡柴的良種選育、規(guī)范化栽培和臨床應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

AB135-S型電子分析天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋購自金壇市杰瑞爾電器有限公司；H2016D高速離心機(jī)購自上海知信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MX-S渦旋振蕩器購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；Easy-Cycler 96PCR 擴(kuò)增儀購自德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京市六一生物科技有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計購自美國 Thermo公司；ZF-258全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海嘉鵬科技有限公司；TWD-9403C紫外儀購自北京六一生物科技有限公司。

DP3112 植物組織DNA 提取試劑盒購自無錫百泰克生物技術(shù)有限公司；PremixTaqDNA 酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；引物由美國Thermo公司合成；DL2000 DNA Marker、瓊脂糖、5×TBE緩沖液、無酶無菌水、TE 緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用北柴胡供試品來源于甘肅、山西、河南、內(nèi)蒙古等10個產(chǎn)地（表1）。于2021年4月15日—5 月1 日進(jìn)行取樣，分別取各居群新鮮、健康的柴胡植株葉片葉尖。將采集樣品帶回實(shí)驗(yàn)室-25 ℃保存?zhèn)溆?。所有?shí)驗(yàn)材料經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)劉計權(quán)教授鑒別，均屬于傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.。

表1 不同產(chǎn)地北柴胡環(huán)境因子原始數(shù)據(jù)Table 1 Raw data of environmental factors of B. chinense from different producing areas

1.3 北柴胡DNA的提取

取新鮮北柴胡葉片葉尖適量，加入液氮充分研磨至細(xì)粉狀。參照植物組織DNA 提取試劑盒說明書提取樣品DNA，采用精密紫外分光光度計測定OD260/OD280及DNA 濃度，剩余的DNA 樣品于-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.4.1 PremixTaq-DNA 酶的最佳加入量 結(jié)合文獻(xiàn)［9-10］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共45 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。本實(shí)驗(yàn)使用引物808，PCR 擴(kuò)增采取25 μL反應(yīng)體系，包括模板DNA 20 ng、10 μmol·L-1引物2 μL，PremixTaqDNA酶設(shè)置了10.0、12.5、15.0 μL 3 個體積，無酶無菌水補(bǔ)足。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，5 V·cm-1電壓條件下電泳45 min，以DL2000 DNA marker 為對照，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.4.2 模板DNA 的最佳加入量 在確定Premix

Taq-DNA 酶量的基礎(chǔ)上，設(shè)置20、40、60 ng 3 個模板DNA 用量梯度，觀察模板DNA 用量對ISSRPCR擴(kuò)增的影響，選擇最佳加入量。

1.4.3 最適引物及最佳加入量 參照UBC 發(fā)布的ISSR引物，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［11-13］，選取擴(kuò)增條帶較多且條帶清晰的引物，每種引物分別設(shè)置1、2、4 μL 3個梯度。將擴(kuò)增產(chǎn)物放置于紫外照射箱觀察，依據(jù)生成條帶的明顯程度，篩選出最適合的引物種類與濃度。

1.5 不同居群北柴胡遺傳多樣性分析

對10 個北柴胡的DNA 樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，并統(tǒng)計擴(kuò)增條帶。按相同遷移位置上有擴(kuò)增條帶的不論強(qiáng)弱記為“1”，無帶記為“0”，得到全部樣品的圖譜二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣，用NTSYSpc-2.1 軟件進(jìn)行計算，獲得樣品的遺傳相似系數(shù)矩陣。用UPGMA方法依據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 北柴胡DNA的提取

經(jīng)超微量分光光度計測量，液氮提取不同居群北柴胡DNA 所得結(jié)果較為良好，OD260/OD280比值均高于1.8，證明10 個樣地所提取的雙鏈DNA純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體測定結(jié)果見表2。居群濃度/(ng·μL-1)純度/(A260/A280)

表2 柴胡樣品的DNA濃度和質(zhì)量Table 2 DNA concentration and quality of B. chinense samples

2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 PremixTaq-DNA 酶的最佳加入量 由圖1

圖1 Premix Taq-DNA酶含量對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響Fig. 1 Effect of premix Taq-DNA enzyme content on ISSR-PCR amplification

可知體系中加入10 μL 和15 μLTaq-DNA 酶時，呈現(xiàn)的條帶亮度較弱，當(dāng)加入12.5 μLTaq-DNA酶時，出現(xiàn)了特征明顯的發(fā)光亮帶。因此，在本次實(shí)驗(yàn)條件下，25 μl反應(yīng)體系中Taq-DNA酶最適用量為12.5 μL。

2.2.2 模板DNA 的最佳加入量 由圖2 所示，當(dāng)模板DNA 為20 ng 時，擴(kuò)增條帶較弱；40 ng 時擴(kuò)增條帶最弱且不清晰，而DNA 用量為60 ng 時擴(kuò)增結(jié)果最佳，因此本實(shí)驗(yàn)選擇60 ng為反應(yīng)體系中模板DNA的用量。

圖2 模板DNA用量對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響Fig. 2 Influence of template DNA dosage on ISSR-PCR amplification

2.2.3 最適引物及最佳加入量 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了引物種類與用量，選取4 條擴(kuò)增條帶較多且條帶清晰的引物（表3）。由圖3 可以看出當(dāng)選擇840 引物2 μL 時，條帶清晰且穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇840 作為最適引物，引物量以2 μL為最佳。

圖3 不同引物及用量對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響Fig. 3 Influence of different primers and dosage on ISSR-PCR amplification

表3 北柴胡ISSR分析的引物序列及其最佳退火溫度Table 3 Primers sequence and optimum annealing temperature for ISSR analysis of B. chinense

2.3 不同居群北柴胡遺傳多樣性分析

2.3.1 ISSR-PCR擴(kuò)增檢測 由2.2進(jìn)行的ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定ISSR-PCR 分析最適宜的25 μL PCR 反應(yīng)體系：模板DNA 60 ng，PremixTaqDNA 酶12.5 μL，840引物（10 mmol·L-1）2 μL，無酶無菌水補(bǔ)足。10個北柴胡樣品使用840引物均可以擴(kuò)增出清晰的條帶，大部分?jǐn)U增片段分子量在250~1 500 bp，具體結(jié)果如圖4所示。

圖4 10份北柴胡樣品的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 ISSR-PCR amplification results of 10 B. chinense samples

2.3.2 北柴胡樣品遺傳相似性分析 由表4 可知，10 個北柴胡樣品的遺傳相似系數(shù)為0.142 8~1.000 0。其中，襄汾、渾源、廣靈與慶陽柴胡之間的遺傳相似系數(shù)最小為0.142 8，聞喜與平陸柴胡、清水河與臨汾柴胡、陵川與嵩縣柴胡、廣靈與渾源柴胡之間的遺傳相似系數(shù)最大為1.000 0，這表明10 個北柴胡樣品種間存在著一定程度的遺傳差異。從遺傳相似系數(shù)可看出，慶陽柴胡與其他9 個產(chǎn)地柴胡的遺傳相似系數(shù)均較小，表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而這9 個產(chǎn)地柴胡兩兩間存在著不同程度的遺傳相似性，表明9 個北柴胡樣品種間存在著一定程度的遺傳差異。

表4 10份北柴胡樣品的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficients of 10 B. chinense samples

2.3.3 聚類分析 由圖5 所示，相似系數(shù)為0.63時，可把10個北柴胡樣品聚成3大類。第1類只有甘肅慶陽柴胡；第2 類包括5 個柴胡樣品，分別為陵川、嵩縣、聞喜、平陸、襄汾柴胡，均屬于山西省南部居群及河南省居群，其中陵川與嵩縣親緣關(guān)系較近，聞喜與平陸親緣關(guān)系較近；第3 類包括4 個柴胡樣品，即為清水河、臨汾、渾源、廣靈柴胡，屬于山西省北部居群及內(nèi)蒙古居群。其中，渾源與廣靈親緣關(guān)系較近，臨汾與清水河親緣關(guān)系較近。

圖5 北柴胡居群的遺傳多樣性聚類圖Fig. 5 Clustering map of genetic diversity of B. chinense population

3 討論

物種或居群的遺傳多樣性大小是長期進(jìn)化的產(chǎn)物，也是其生存和發(fā)展的前提［11］，居群間存在遺傳多樣性或遺傳變異，一部分原因是由于環(huán)境因素的改變和土壤條件的惡化。遺傳相似性系數(shù)或遺傳距離是衡量居群間遺傳分化程度的重要指標(biāo)［12］。因此，對遺傳多樣性的研究一方面解釋了物種的進(jìn)化，另一方面也為尋找優(yōu)良的種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。目前，用于中藥材的分子標(biāo)記技術(shù)很多，例如SCoT、ISSR、SSR、SNP等，其中ISSR技術(shù)有著多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，且能夠在樣品基因組序列未知的情況下對樣品間的遺傳信息進(jìn)行多樣化分析，同時不受物種的限制，在香附、黃精、伊貝母、柴胡等重點(diǎn)中藥材上已有相關(guān)應(yīng)用［13-14］。此外，引物濃度也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，濃度過高可能導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低可能降低PCR擴(kuò)增效率［15］。因此，有必要圍繞引物適宜的濃度進(jìn)一步設(shè)置梯度濃度以探究實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。

從聚類圖中可以看出，第2類中5個北柴胡樣品不僅僅局限于山西省南部居群，還有河南省嵩縣北柴胡樣品與其聚為一類，這可能是因?yàn)閮傻叵噜?，生境、光溫水等條件較為一致，導(dǎo)致北柴胡間的遺傳相似系數(shù)較近；第3 類中內(nèi)蒙古清水河居群北柴胡未按照其地理位置獨(dú)為一類，而是與山西北部居群聚為一類。這可能是山西北部地區(qū)由于受內(nèi)蒙古冬季冷氣團(tuán)的襲擊，氣候較為寒冷，兩地環(huán)境條件較為相似，自然選擇壓力一致導(dǎo)致的。因此，可以推斷親緣關(guān)系與地理位置的遠(yuǎn)近有著密切的聯(lián)系。

李勇慧等［8］通過對我國北柴胡6個居群的11個樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)6 個居群北柴胡存在比較豐富的遺傳變異，且與地理分布有一定相關(guān)性。馬艷芝等［9］采用ISSR 標(biāo)記和ITS 序列分析方法將11 份柴胡樣品分成2 大類，其中大部分來源相同或相近的柴胡樣品聚在一起。以上文獻(xiàn)有關(guān)結(jié)論與本研究聚類分析結(jié)論基本一致。

隨著北柴胡的經(jīng)濟(jì)價值與藥用價值不斷被開發(fā)，北柴胡的需求量逐日遞增，越來越多的地方正在進(jìn)行北柴胡的栽培，但產(chǎn)地之間的親緣關(guān)系并不清楚。當(dāng)前越來越多的中藥材已經(jīng)開始在分子層面上進(jìn)行分析，足見分子技術(shù)對中藥材研究的重要性。本研究從ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)獲得的結(jié)果來看，不同柴胡種群間存在較為豐富的遺傳多樣性，原則上能夠按照地理位置的遠(yuǎn)近加以分類，這對于柴胡遺傳差異性的深入研究、種質(zhì)評價和良種選育均有重要意義。未來，課題組將會在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上深入研究北柴胡遺傳多樣性與化學(xué)成分、外觀性狀之間的關(guān)聯(lián)。