冷鏈食品中銅綠假單胞菌的檢測方法研究及進化樹構(gòu)建

柯振華

福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（福州），福州 350000

冷鏈食品是指在產(chǎn)品加工、貯藏、運輸、分銷和零售和到消費者手中，其各個環(huán)節(jié)始終處于產(chǎn)品所必需的低溫環(huán)境下，以保證食品質(zhì)量安全，減少損耗，防止微生物污染的特殊供應(yīng)鏈系統(tǒng)。冷鏈食品包括但不限于易腐食品，如肉類、禽類、魚類、蛋類、奶制品等［1-3］。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，屬于非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于人類皮膚、腸道和呼吸道等，是臨床上常見的條件致病菌之一［4］。銅綠假單胞菌菌體細長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。在臨床醫(yī)學(xué)中，銅綠假單胞菌容易引發(fā)患者術(shù)后的傷口感染，對于燒傷患者嚴重時可能會造成死亡［5-8］。

目前，國內(nèi)對于銅綠假單胞菌的檢測主要基于微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定方法［9-13］，其操作步驟復(fù)雜、流程多且對檢驗人員的檢測經(jīng)驗要求很高，容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果，因此亟需開發(fā)更加高效科學(xué)的檢驗方法。同時，國內(nèi)對于食品中銅綠假單胞菌的檢測主要集中于包裝飲用水或者桶裝飲用水［14-17］，對于其他類別食品特別是冷鏈食品中銅綠假單胞菌的檢測，未見相關(guān)研究報道。本研究基于分子生物學(xué)方法，擬開發(fā)冷鏈食品中銅綠假單胞菌的實時熒光定量PCR 檢測方法將其應(yīng)用于實際樣品抽樣檢測工作中，并構(gòu)建了銅綠假單胞菌生物進化樹，以期為解決銅綠假單胞菌污染溯源問題提供創(chuàng)新性的研究方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標準菌株 銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌等標準菌株均來自于福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院菌種保藏室，采用磁珠法凍存。

1.1.2 樣品采集 冷鏈食品如冷鮮肉類、速凍水產(chǎn)品等樣品均隨機采集自市場，用無菌袋封裝后置于冷藏保溫箱中，運輸至實驗室后，在二級生物安全實驗室開展銅綠假單胞菌檢測研究工作。

1.1.3 試劑 微生物培養(yǎng)基等試劑購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；TaqProbe PCR-Multiplex Mix預(yù)混液，柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。實時熒光PCR檢測所需引物探針委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

實時熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)（ABI 7500）；小型離心機（Eppendorf）；生物安全柜（Baker）；微生物鑒定藥敏系統(tǒng)（梅里埃）。

1.3 實驗方法

1.3.1 預(yù)增菌 稱取25 g試樣加入225 mL SCDLP液體培養(yǎng)基，置于36 ℃培養(yǎng)18 h。

1.3.2 試劑盒法提取菌液DNA 在完成預(yù)增菌后，按照試劑盒說明書應(yīng)用柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取預(yù)增菌液中的菌體DNA。

1.3.3 引物與探針的設(shè)計與合成 本研究依據(jù)銅綠假單胞菌的保守基因序列設(shè)計引物和熒光標記的探針，具體見表1。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes

1.3.4 實時熒光PCR 檢測反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液5 μL、25 mmol·L-1氯化鎂溶液4 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、正反引物各（10 μmol·L-1） 1 μL、探針（10 μmol·L-1） 1 μL、Taq酶1 μL、模板DNA 3 μL、ddH2O 31 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，共45 個循環(huán)。

1.3.5 PMA-qPCR 檢測目標病原菌的靈敏度 經(jīng)同步涂布平板檢驗，取銅綠假單胞菌菌液濃度為107CFU·mL-1，逐級稀釋，最終制備成梯度濃度分別為106、105、104、103、102、10 CFU·mL-1的稀釋菌液，采用上述實時熒光PCR 檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進行檢測，以確定方法檢測靈敏度。

1.3.6 冷鏈食品中銅綠假單胞菌的檢測分析 從市場中采集了不同類型的冷鏈食品共計271 份樣品，采用實時熒光PCR檢測方法開展檢測工作。

1.3.7 銅綠假單胞菌溯源分析以及分子進化樹的構(gòu)建 將冷鏈食品中分離得到的銅綠假單胞菌菌株進行分離純化，通過基因測序獲得細化后菌株的16S rRNA 序列，其余用于構(gòu)建菌株分子進化樹的假單胞菌屬16S rRNA 序列均檢索自美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，具體序列信息見表2。

表2 分子進化樹構(gòu)建所用假單胞菌屬菌株序列信息Table 2 Sequence information of Pseudomonas strains used in molecular tree construction

使用BioEdit 軟件對實驗室分離所得的銅綠假單胞菌基因序列以及NCBI 中搜索得到的基因序列進行處理，利用Clustal W軟件對基因序列進行整合比對分析，利用MEGA X 軟件構(gòu)建銅綠假單胞菌16S rRNA分子生物進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測反應(yīng)結(jié)果

為分析銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測方法的特異性與靈敏度，研究對本實驗室菌種保藏中心已有的假單胞菌屬銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、熒光假單胞菌開展檢測分析，結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，銅綠假單胞菌引物探針只對銅綠假單胞菌有特異性擴增曲線，對于陰性對照菌包括惡臭假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌以及熒光假單胞菌未見擴增曲線。這表明本研究建立的實時熒光PCR檢測反應(yīng)體系只對陽性靶標菌銅綠假單胞菌有良好的擴增，對空白對照以及陰性對照菌株均無擴增，可以應(yīng)用于冷鏈食品中銅綠假單胞菌的實時熒光PCR檢測。

圖1 銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測擴增結(jié)果Fig. 1 Amplification results of real-time fluorescence PCR detection of Pseudomonas aeruginosa

2.2 銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測方法檢出限

通過將銅綠假單胞菌菌液稀釋檢測，最終確定銅綠假單胞菌的方法檢出限為1×103CFU·mL-1。

2.3 冷鏈食品中銅綠假單胞菌的檢測

為了驗證研究方法的適用性與可操作性，掌握食品特別是冷鏈食品中銅綠假單胞菌的污染情況，本研究共從超市、農(nóng)貿(mào)市場等地方隨機抽取了271 份樣品開展銅綠假單胞菌檢驗工作，結(jié)果共檢出10 株銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌的總體檢出率為3.69% （10/271）。

2.4 方法比對試驗結(jié)果

研究將3 種銅綠假單胞菌檢測方法，包括本研究開發(fā)的實時熒光PCR 檢測方法、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法以及全自動生化儀器鑒別法進行比對，比對結(jié)果完全一致，因此可說明本研究方法的可靠性與穩(wěn)定性。

2.5 銅綠假單胞菌溯源結(jié)果以及進化樹構(gòu)建

我們將冷鏈食品中檢測出的10株銅綠假單胞菌（自編號分別為YS-1、YS-2、YS-3、YS-9、YS-36、YS-37、YS-38、YS-39、YS-NL-21、YS-NL-23）進行測序分析，測序結(jié)果用于構(gòu)建生物進化樹，以比較假單胞菌屬各菌株之間的親緣關(guān)系，具體進化樹見圖2。

圖2 假單胞菌屬的分子進化樹分析Fig. 2 Molecular phylogenetic tree analysis of Pseudomonas spp.

通過構(gòu)建生物進化樹，可以看出，所有菌株根據(jù)在進化樹中的分布主要分為3大分支，本實驗室分離得到的YS-1、YS-2、YS-3、YS-9、YS-36、YS-37、YS-38、YS-39、YS-NL-21、YS-NL-23 菌株序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中編號為銅綠假單胞菌（NR117678.1）聚類到一支，均為銅綠假單胞菌，與拉爾夸南假單胞菌（NR_179771.1）、古河假單胞菌（NR_179202.1）、博阿南假單胞菌（NR_181770.1）集中分布一支。

通過進化樹分析，可以看出本研究分離的銅綠假單胞菌野生菌株與其他單胞菌屬菌株的基因同源性大小與親緣關(guān)系的遠近，同時也反映出本研究分離的銅綠假單胞菌野生菌株與其他類型單胞菌菌株存在一定程度的變異。因此，可以成功溯源冷鏈食品中所分離銅綠假單胞菌的種屬分類與地位。

3 討論

隨著冷鏈食品的日益普及，冷鏈食品所帶來的食品安全風(fēng)險越來越大，但是國內(nèi)對于冷鏈食品中病原菌的檢測鮮有報道，且未見冷鏈食品中銅綠假單胞菌的檢測數(shù)據(jù)或者預(yù)警分析報告［19-22］。由于銅綠假單胞菌是條件致病菌，對于燒傷或者有創(chuàng)傷病人具有潛在的危害，若不加以控制，很可能會導(dǎo)致術(shù)后感染并引發(fā)相關(guān)并發(fā)癥［23］。

分子生物學(xué)分析手段目前日益普及，對于親緣關(guān)系鑒定以及病原菌的種屬定位具有巨大的優(yōu)勢，測序分析可以快速確定病原菌種類并分析不同病原菌之間的相互關(guān)系，同時進化樹分析可以直觀明了地看出各病原菌定位與種屬關(guān)系。

本研究開展了冷鏈食品中銅綠假單胞菌的檢測與分析，通過冷鏈食品采樣分析與檢測，得到冷鏈食品中銅綠假單胞菌污染數(shù)據(jù)以及污染水平，對于冷鏈食品監(jiān)管以及消費者健康安全有重要的指導(dǎo)作用。

目前，國內(nèi)對于銅綠假單胞菌從分離、培養(yǎng)到鑒定一般需要5~7 d時間［24-26］。為了縮短檢測時間、提高檢測效率，本研究將實時熒光PCR檢測方法與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，可在18 h 內(nèi)完成假單胞菌的高通量檢測。從市場隨機抽樣的冷鏈食品中分離得到了銅綠假單胞菌，通過構(gòu)建生物進化樹分析病原菌的種屬及親緣關(guān)系，從基因本質(zhì)上完成銅綠假單胞菌的種屬定位溯源分析，研究結(jié)果對于提升食品質(zhì)量、守護食品安全具有重要意義。通過方法間比對與冷鏈食品抽樣檢測，本研究方法穩(wěn)定可靠，可以廣泛應(yīng)用于冷鏈食品及相關(guān)食品中病原菌的快速篩查檢測與病原菌分子溯源分析。未來將繼續(xù)擴大采樣范圍以及采樣數(shù)量，并將方法進一步應(yīng)用于更多不同種類的食品檢測中。