利用產(chǎn)氫強(qiáng)化微生物降解原油產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)

侯兆偉 劉 洋 金 銳 李 蔚竇緒謀 任國(guó)領(lǐng) 張 琨

（1. 國(guó)家能源陸相砂巖老油田持續(xù)開采研發(fā)中心，黑龍江 大慶 163712；2. 中國(guó)石油大慶油田有限責(zé)任公司勘探開發(fā)研究院，黑龍江 大慶 163712；3. 大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163712）

0 引 言

大慶油田經(jīng)過水驅(qū)、化學(xué)驅(qū)等開發(fā)階段后，仍然有30%～40%的原油滯留在地下，現(xiàn)有技術(shù)無法經(jīng)濟(jì)、有效地開發(fā)［1］。利用微生物作用將殘余油降解轉(zhuǎn)化成甲烷，以天然氣形式開采，為這部分殘余油的開發(fā)提供了一條有益的技術(shù)思路［2］。目前普遍認(rèn)為烷烴厭氧生物降解過程是多菌種參與、多步驟的反應(yīng)，需要由不同功能菌群共同參與反應(yīng)才能持續(xù)進(jìn)行［3-5］。其中一些厭氧菌與產(chǎn)甲烷菌具有相似的氧化還原電位和可利用的營(yíng)養(yǎng)底物以及電子受體，彼此間產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)抑制削弱了產(chǎn)甲烷效率。根據(jù)代謝底物類型可將產(chǎn)甲烷菌分為3 類：乙酸營(yíng)養(yǎng)型、甲基營(yíng)養(yǎng)型以及氫營(yíng)養(yǎng)型。除了部分專性乙酸營(yíng)養(yǎng)型與甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌外，在目前已培養(yǎng)的模式菌株中，3/4 以上的產(chǎn)甲烷古菌屬于利用CO2和H2產(chǎn)甲烷的氫營(yíng)養(yǎng)型［6］。3 種營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對(duì)應(yīng)3 種代謝方式：乙酸發(fā)酵途徑、甲基裂解途徑、H2/CO2還原途徑。理論上在反應(yīng)前期（甲烷濃度不高的階段）提供只能被產(chǎn)甲烷菌專一利用的底物，產(chǎn)甲烷效率就會(huì)進(jìn)一步提高。鑒于H2和CO2只能被氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用，特別是H2不易被其他菌群競(jìng)爭(zhēng)利用的特點(diǎn)，若先激活微生物產(chǎn)氫再產(chǎn)甲烷，則能為氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌提供充足的底物，產(chǎn)甲烷效率會(huì)進(jìn)一步提高。

在產(chǎn)甲烷體系中，H2還可以作為電子載體進(jìn)行種間電子傳遞，稱為種間氫傳遞［7］。細(xì)菌將有機(jī)底物氧化后產(chǎn)生H2，作為可溶性穿梭體，將電子從供體細(xì)菌傳遞到受體產(chǎn)甲烷菌。H2是氫型產(chǎn)甲烷菌還原CO2生成甲烷的直接電子供體，最終H2在多種酶和輔酶的參與下，通過不同的代謝途徑被氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌消耗產(chǎn)甲烷。目前，H2對(duì)產(chǎn)甲烷效率的影響的相關(guān)研究報(bào)道較少，多見于有機(jī)固體處理［8］、有機(jī)廢水處理［9］和煤礦預(yù)處理［10］等非石油領(lǐng)域的研究報(bào)道。鑒于自然條件下微生物作用原油產(chǎn)甲烷的周期較長(zhǎng)，產(chǎn)甲烷速率較慢，因此本文開展利用微生物產(chǎn)氫來強(qiáng)化微生物作用原油產(chǎn)甲烷能力的實(shí)驗(yàn)，目的在于通過提高產(chǎn)甲烷的速率來進(jìn)一步提高產(chǎn)甲烷能力，達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)利用微生物快速形成甲烷氣的效果。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 材料和儀器

1.1.1 原油和水樣

實(shí)驗(yàn)所用原油來自大慶油田第七采油廠某聯(lián)合站脫水原油，黏度58.0 mPa·s，水樣為第七采油廠油井采出液，水類型為NaHCO3型，總礦化度為5～8 g/L，所用活性污泥來自大慶石化公司污水處理廠N1、N2 曝氣池的底部污泥。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、氯化銨、硫酸鎂、鉬酸鈉、檸檬酸、氯化鈣、硫酸亞鐵、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉等均為分析純，北京化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器與材料

生化培養(yǎng)箱、無菌操作臺(tái)、厭氧操作手套箱、氣相色譜、滅菌鍋、鐵架臺(tái)、試管架、厭氧玻璃瓶、厭氧試管、試管、平皿、三角瓶、燒杯、1 mL 無菌注射器、50 mL 玻璃注射器、水質(zhì)測(cè)試瓶、PCR 儀、DNA 提取試劑盒、電泳儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 產(chǎn)氫功能菌的分離

首先將各試劑按照一定比例配制液體產(chǎn)氫培養(yǎng)基后進(jìn)行高壓滅菌，將約100 mL 滅菌后的培養(yǎng)基分裝到150 mL 無菌厭氧瓶中，放置室溫后每瓶接入1 mL 活性污泥，放置45 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用排水法收集不同時(shí)間所產(chǎn)氣體，用島津GC-14A氣相色譜對(duì)氣體組分的分析結(jié)果來確定是否產(chǎn)生大量氫氣。再將發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，采用夾層平板培養(yǎng)法分離微生物單菌落。具體方法如下（在充滿CO2的厭氧手套箱內(nèi)進(jìn)行）：抽取1 mL 發(fā)酵液進(jìn)行無菌10 倍稀釋，采用夾層平板法涂布；涂好的平皿周圍用塑料封口膜貼封后從厭氧手套箱里取出，放置45 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。此時(shí)夾層中間長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落至含有液體產(chǎn)氫培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)并保存，每個(gè)單菌落對(duì)應(yīng)一個(gè)試管培養(yǎng)。

夾層平板法：先在培養(yǎng)皿中倒一層滅菌后的固體細(xì)菌基礎(chǔ)LB 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L），待冷凝后涂布稀釋后的不同濃度菌懸液，再在其上倒一層瓊脂含量較基礎(chǔ)LB 培養(yǎng)基低的半固體培養(yǎng)基，倒?jié)M整個(gè)平皿；由于培養(yǎng)基瓊脂含量不同，靜置降溫后會(huì)在2 種培養(yǎng)基中間形成一個(gè)供厭氧細(xì)菌生長(zhǎng)的夾層空隙，經(jīng)培養(yǎng)出現(xiàn)單菌落后，用接種針穿過半固體培養(yǎng)基層，將單菌落挑出后即可進(jìn)行下一步操作。

1.2.2 產(chǎn)氫功能菌群的篩選

在一次訪談中，她說：“我是一個(gè)對(duì)自己挺狠的人。而被‘狠’掉的第一條，是情緒。我早把情緒戒掉了，就是和自己死磕，對(duì)自己下命令。有一次，有件事讓我很生氣，我對(duì)自己說，給你二十四小時(shí)的時(shí)間，你必須把這件事壓下去。這一天，什么都不做，讓自己過去?！薄皻⒉凰牢业闹粫?huì)讓我更強(qiáng)大?！彼眯袆?dòng)踐行了這個(gè)道理。這樣的姑娘，得到什么都不足為奇。想起稻盛和夫說過的一句話：“成功不要無謂的情緒?！鄙钜詾槿弧?/p>

將分離出的若干產(chǎn)氫功能菌落分別接種后，放置45℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，測(cè)量其所產(chǎn)氣的氣體組分，其中含氫量高的試管說明產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫能力強(qiáng)，即為篩選目標(biāo)，最終篩選5—7 株產(chǎn)氫效果較好的產(chǎn)氫單菌。

1.2.3 產(chǎn)氫發(fā)酵液菌群結(jié)構(gòu)的鑒定

微生物群落基因組DNA 提取具體步驟見文獻(xiàn)［11］，提取的基因組DNA 儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DNA 濃度通過測(cè)定其在260 nm 下的吸光度確定，DNA 純度通過比較260 nm/230 nm和260 nm/280 nm 的吸光度確定。細(xì)菌16SrRNA 基因擴(kuò)增的是可變區(qū)V3-V4 區(qū)，細(xì)菌擴(kuò)增引物序列為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3'），古菌擴(kuò)增引物序列為524F（5'-TGACAGCCGCCGCGGTAA-3'）和958R（5'-ACCGGCGTTGAATCCAATT-3'）。PCR反應(yīng)體系以10 ng DNA 為模板。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)之后，72 ℃延伸10 min。

使用Illumina 的MiSeq 測(cè)序儀對(duì)16SrRNA 基因的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。使用QIIME 軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。通過flash 軟件將有overlap 的一對(duì)reads 進(jìn)行拼接。進(jìn)行分子生物信息學(xué)序列對(duì)比分析。

1.2.4 產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷兩階段培養(yǎng)

（1）在含有液體產(chǎn)氫培養(yǎng)基和原油的厭氧瓶中接種所篩選的產(chǎn)氫菌，45 ℃下培養(yǎng)7 d 進(jìn)行產(chǎn)氫階段培養(yǎng)，獲得產(chǎn)氫培養(yǎng)體系；

（2）配制液體產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基，各組分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：w（玉米漿粉）0.1%；w（NaH2PO4）0.5%；w（Na2HPO4）0.5%；w（甲酸鈉）0～0.01%；w（乙酸鈉）0～0.01%；w（丙酸鈉）0～0.01%；w（KNO3）0.7%；w（NH4Cl） 0.7%；w（檸檬酸） 0～0.4%；w（石油磺酸鹽）0.01%；w（微量元素母液）0.1%；

微量元素母液各組分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：w（MnCl2·4H2O）0.50%；w（FeCl2·4H2O）1.50%；w（NiCl2·6H2O） 0.2%；w（CoCl2·6H2O） 0.5%；w（CaCl2·2H2O）0.1%；w（Na2MoO4·2H2O）0.01%；w（ZnCl2） 0.5%；w（AlCl3） 0.01%；w（H3BO3）0.02%；w（CuSO4·5H2O）0.1%。

產(chǎn)甲烷培養(yǎng)：將配制好的液體產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基分裝到厭氧玻璃瓶中后滅菌，室溫下按照質(zhì)量濃度1 g/L 比例添加原油后再接種1%活性污泥，45 ℃下培養(yǎng)90 d 獲得產(chǎn)甲烷發(fā)酵液。

（3）配置pH 為10 的堿性A 飽和溶液，然后對(duì)已培養(yǎng)的產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中加入堿性溶液A，將產(chǎn)氫發(fā)酵體系的pH 調(diào)解到6.5～7.0 后，分別再接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的N1、N2 產(chǎn)甲烷發(fā)酵菌液，再放置45 ℃培養(yǎng)。采用排水法對(duì)不同時(shí)間段所產(chǎn)氣體進(jìn)行收集。具體操作：在帶有橡膠塞的厭氧管中裝滿飽和NaHCO3溶液，嚴(yán)密封口，采用50 mL 注射器收集培養(yǎng)體系頂空氣體并將其注入到裝滿飽和NaHCO3溶液的厭氧管中，一端插入針管進(jìn)行排液，將注射器內(nèi)的氣體注射進(jìn)厭氧管中，最終收集到氣體。再用氣相色譜專用注射器將所收集到的氣體從收集管取出，注射進(jìn)氣相色譜儀，對(duì)氣體進(jìn)行組分分析。

1.2.5 發(fā)酵液各理化參數(shù)的測(cè)定

（1）pH 測(cè)定，采用不同范圍和精度的pH 試紙進(jìn)行測(cè)定；（2）發(fā)酵液脫氫酶含量測(cè)定，采用2，3，5—氯化三苯基四氮唑法進(jìn)行測(cè)定［12］；（3）發(fā)酵液輔酶F420測(cè)定，采用分光光度法［13］測(cè)定輔酶F420的含量；（4）發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸VFA 含量的測(cè)定，參考任南琪等［14］所著《產(chǎn)酸發(fā)酵微生物生理生態(tài)學(xué)》附錄部分有關(guān)VFA 測(cè)定；（5）微生物種類與數(shù)量測(cè)定，采用MPN 法對(duì)水樣及其污泥中內(nèi)源微生物種類和數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)（參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T 0532—2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》）；（6）氣體組分測(cè)定，采用氣相色譜對(duì)所收集的氣體組分進(jìn)行分析（參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13610—2020《天然氣的組成分析 氣相色譜法》）。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性污泥中產(chǎn)氫菌的分離

采用MPN 法對(duì)活性污泥懸液中內(nèi)源微生物種類和濃度進(jìn)行檢測(cè)。相比油井采出液中的內(nèi)源微生物濃度，大慶石化公司污水處理廠的活性污泥懸液中含有大量消化功能的微生物，包括烴氧化菌（HOB）、腐生菌（TGB）、硝酸鹽還原菌（NRB）、硫酸鹽還原菌（SRB）、乙酸菌（APB）、鐵細(xì)菌（FB）和產(chǎn)甲烷菌（MPB），其本源菌菌群組成見表1，其濃度為103～106個(gè)/mL，普遍較地層水采出液中的內(nèi)源微生物濃度高出102～103個(gè)/mL。目前國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于活性污泥產(chǎn)氫的報(bào)道［15-16］，但大多數(shù)都是基于污水廢水生物處理的研究，很少涉及到原油等烷烴的微生物厭氧降解產(chǎn)甲烷的研究。本實(shí)驗(yàn)采用每支厭氧玻璃培養(yǎng)瓶中裝入含有1 g/L 原油的液體產(chǎn)氫培養(yǎng)基，高溫滅菌后接種體積分?jǐn)?shù)1%的活性污泥，45 ℃恒溫培養(yǎng)后，起到利用活性污泥所含有的微生物作用原油同時(shí)產(chǎn)氫的效果。

表1 不同污泥與采出液的內(nèi)源微生物菌濃度Table 1 Endogenous microbial bacteria concentration in different sludge and produced liquid

由表2 可知，在N2 污泥培養(yǎng)后的第7 天每100 mL 發(fā)酵液所產(chǎn)主要?dú)怏w中的氫氣體積分?jǐn)?shù)最高可達(dá)到43.04%，產(chǎn)氣46 mL，產(chǎn)氫量0.89 mmol，具有較好的產(chǎn)氫能力。從其發(fā)酵液中篩選的產(chǎn)氫功能菌見圖1（a）、（b），挑選6 個(gè)單菌落進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并對(duì)其發(fā)酵液的二次轉(zhuǎn)接產(chǎn)氫能力進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)菌落產(chǎn)氫及其二次轉(zhuǎn)接后的產(chǎn)氫量穩(wěn)定在1.4 mmol 左右，說明菌株產(chǎn)氫能力穩(wěn)定，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用菌株。另外從表2 可看出地層水的產(chǎn)氫能力較弱，不適合作為產(chǎn)氫菌的篩選目標(biāo)。

圖1 從活性污泥中分離的產(chǎn)氫菌照片F(xiàn)ig. 1 Photos of hydrogen produced bacteria separated from active sludge

圖2 不同單菌落的產(chǎn)氫量Fig. 2 Hydrogen production of different single bacteria colonies

表2 不同污泥與采出液產(chǎn)氫能力Table 2 Hydrogen production capacity of different sludge and produced liquid

對(duì)N2 污泥發(fā)酵液中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子生物學(xué)測(cè)序鑒定，檢測(cè)結(jié)果表明：按照相對(duì)豐度由大到小排列，占比最多的是具有產(chǎn)酸產(chǎn)氣功能的梭菌屬（Clostridiumsp.）約占39%；其次是能夠厭氧降解烷烴，生成小分子酸和H2的互營(yíng)菌（norank_f_Synergistaceae）約占21%；其余是能利用葡萄糖產(chǎn)乙酸和H2的未命名菌屬（norank_f_Lentimicrobiacenae）約占10%；產(chǎn)乙酸產(chǎn)氣的厭氧桿菌（Anaerobaculumsp.）約占9%；具有互營(yíng)降解脂肪酸能力的熱厭氧桿菌（Tepidanaerobactersp.） 約占6%；能夠分解碳水化合物產(chǎn)H2的（Mesotogasp.）約占5%和一些能夠進(jìn)行暗發(fā)酵厭氧產(chǎn)氫的丁酸芽孢桿菌屬（Trdiumbutyricum）和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）。證明了N2 污泥發(fā)酵液中含有豐富的產(chǎn)酸產(chǎn)氫功能菌群。

2.2 產(chǎn)氫培養(yǎng)基優(yōu)化

為了提高產(chǎn)氫能力，對(duì)產(chǎn)氫培養(yǎng)基的組成進(jìn)一步篩選調(diào)整（表3），發(fā)現(xiàn)N2 污泥的培養(yǎng)體系在添加微量物質(zhì)（納米四氧化三鐵粉末A、L 半胱氨酸B）和糖蜜培養(yǎng)4 d 后，所產(chǎn)氣體中氫氣體積分?jǐn)?shù)最高可達(dá)到51.84%。通過計(jì)算，其每100 mL 發(fā)酵液所產(chǎn)氣體的總氫量達(dá)到1.63 mmol，與所分離菌株產(chǎn)氫0.8 mmol 左右相比，產(chǎn)氫量提高了1 倍左右。對(duì)發(fā)酵液的pH 和揮發(fā)性脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在1～2 d pH 顯著降低，最終4 d 后pH 達(dá)到3.5 左右（圖3），呈現(xiàn)酸性。

圖3 產(chǎn)氫發(fā)酵液pH與時(shí)間的關(guān)系Fig. 3 Relationship between hydrogen produced fermentation liquid pH and time

表3 不同有機(jī)物培養(yǎng)基組分及產(chǎn)氫能力的優(yōu)化Table 3 Components and hydrogen production capacity optimization of different organic cultivation

通過測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）質(zhì)量濃度曲線（圖4），求得N1、N2 發(fā)酵液的揮發(fā)性脂肪酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到2 054 和2 260 mg/L，表明揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生大量積累。已知可溶性碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等的產(chǎn)氫以丁酸型發(fā)酵為主［17］，這是一種經(jīng)典的發(fā)酵方式，發(fā)酵產(chǎn)生的末端產(chǎn)物主要為丁酸、乙酸、H2、CO2和少量的丙酸。丁酸型發(fā)酵途徑主要是在梭菌屬作用下進(jìn)行的。而且根據(jù)已有研究結(jié)果表明：產(chǎn)甲烷菌較產(chǎn)氫菌適應(yīng)的環(huán)境pH 較為嚴(yán)格，過酸或過堿的環(huán)境都會(huì)抑制產(chǎn)甲烷甚至不產(chǎn)甲烷［18］，所以在產(chǎn)氫階段過后，即使作為產(chǎn)甲烷的前體物質(zhì)VFA 大量積累也不產(chǎn)甲烷，若轉(zhuǎn)入產(chǎn)甲烷階段，需要對(duì)產(chǎn)氫后的培養(yǎng)基pH 進(jìn)行調(diào)解中和至中性后才能繼續(xù)進(jìn)行。

圖4 揮發(fā)性脂肪酸質(zhì)量濃度Fig. 4 VFA mass concentration

產(chǎn)氫過程中的小分子有機(jī)物氧化降解與脫氫酶活性相關(guān)。脫氫酶是一類能催化糖類、有機(jī)酸、氨基酸進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的酶，其將底物氧化脫氫，成為氫供體或電子供體。通過測(cè)定脫氫酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）來計(jì)算厭氧培養(yǎng)體系發(fā)酵液中脫氫酶活性值。利用此方法可以間接評(píng)價(jià)微生物產(chǎn)氫體系的反應(yīng)活性。優(yōu)化后的產(chǎn)氫體系脫氫酶酶活達(dá)到了168 mg/L，與優(yōu)化前的酶活42.6 mg/L 相比，提高了2.95 倍，其活性值的提高與產(chǎn)氫能力的提高呈正比。

圖5 脫氫酶活性曲線Fig. 5 Dehydrogenase activity curve

2.3 產(chǎn)甲烷培養(yǎng)效果

對(duì)活性污泥的產(chǎn)甲烷能力進(jìn)行了驗(yàn)證，45 ℃培養(yǎng)后產(chǎn)生大量氣體（圖6），培養(yǎng)10 d 后產(chǎn)氣量基本保持不變，其中接種N1 污泥培養(yǎng)產(chǎn)氣56 mL，接種N2 污泥的培養(yǎng)產(chǎn)氣60 mL。培養(yǎng)90 d 后對(duì)其所產(chǎn)氣體進(jìn)行氣體組分分析，檢測(cè)到甲烷氣體，其中N1 樣品甲烷體積分?jǐn)?shù)為37.294%，N2 污泥樣品甲烷體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到55.429%。結(jié)果表明活性污泥具有產(chǎn)氫能力的同時(shí)還具有產(chǎn)甲烷能力，根據(jù)甲烷總質(zhì)量m甲烷=V甲烷ρ甲烷（ρ甲烷=0.717 g/L）計(jì)算得到N1、 N2 污泥所產(chǎn)甲烷總量分別為0.936 和1.49 mmol，相應(yīng)的產(chǎn)甲烷速率平均為0.013 mmol/d，單位質(zhì)量原油作用下的產(chǎn)甲烷轉(zhuǎn)化率（m甲烷/m原油）平均達(dá)到19.4%，結(jié)果表明活性污泥作用原油具有良好的產(chǎn)氣產(chǎn)甲烷效果。

圖6 不同污泥體系的產(chǎn)氣量Fig. 6 Gas production of different sludge systems

產(chǎn)甲烷菌是生命進(jìn)化史上最古老的單細(xì)胞生命體。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷古菌共有7 個(gè)目［19］，包括Methanomicrobiales、Methanobacteriales、Methanococcales、Methanocellales、Methanopyrales、Methanosarcinales 以及近年發(fā)現(xiàn)的Methanomassiliicoccales，均屬于廣古菌門Euryarchaeota。對(duì)產(chǎn)甲烷效果較好的N2 培養(yǎng)體系激活后的產(chǎn)甲烷古菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，豐度最高達(dá)45%的Methanothrix屬于Methanosarcinales 目，是典型的乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，可以直接利用乙酸產(chǎn)甲烷；豐度達(dá)25%的Methanosarcina，也是一類乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌；豐度達(dá)20%的Methanothermobacter屬于Methanobacteriales 目，是一類嗜熱氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌；而Methanomassiliicoccus屬于產(chǎn)甲烷菌“第七目”，存在于許多厭氧環(huán)境中，如海洋棲息地、土壤、濕地等，但從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)角度而言，它與產(chǎn)甲烷菌的其他目均相距較遠(yuǎn)，該菌是一類甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，即能利用甲基類物質(zhì)，如甲酸、甲醇等來產(chǎn)甲烷。由此可以看出N2 發(fā)酵液的產(chǎn)甲烷菌以小分子有機(jī)酸（乙酸）代謝產(chǎn)甲烷為主，H2的存在增加了可利用的底物范圍，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌進(jìn)一步會(huì)提高體系的產(chǎn)甲烷能力。

2.4 產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷發(fā)酵結(jié)合實(shí)驗(yàn)

微生物產(chǎn)氫反應(yīng)2〔H+〕+2e-→H2發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，是由氫化酶催化的可逆反應(yīng)，其中電子（e-）來源于有機(jī)物，還原氫〔H+〕（是由水產(chǎn)生轉(zhuǎn)化）來源于細(xì)胞水，并在氫化酶的作用下所產(chǎn)H2的同位素組成與水介質(zhì)之間迅速達(dá)到氫同位素的平衡［20］。即在有水的環(huán)境下，只要滿足微生物的產(chǎn)氫條件即可產(chǎn)氫，可用來進(jìn)一步產(chǎn)甲烷。產(chǎn)甲烷菌處于油藏微生物生態(tài)位的最末端，與其他地層微生物包括產(chǎn)氫微生物形成一種特殊的互營(yíng)關(guān)系，油藏微生物各種群利用這種互營(yíng)關(guān)系持續(xù)降解石油烴，所以可以將產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷兩個(gè)階段進(jìn)行有機(jī)結(jié)合。

將優(yōu)化后的產(chǎn)氫體系與產(chǎn)甲烷發(fā)酵液進(jìn)行結(jié)合，設(shè)計(jì)出產(chǎn)氫與產(chǎn)甲烷兩階段結(jié)合培養(yǎng)產(chǎn)甲烷。氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用已有的H2和CO2合成甲烷，乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用發(fā)酵液中已有的小分子有機(jī)酸（鹽）代謝產(chǎn)生甲烷。以N1、N2 產(chǎn)甲烷發(fā)酵液混合接種后再進(jìn)行產(chǎn)甲烷培養(yǎng)的體系做對(duì)照，與同期非結(jié)合培養(yǎng)相比，兩階段結(jié)合途徑的體系培養(yǎng)20 d 后便以甲烷和氫氣為主（表4），且產(chǎn)氫量和甲烷含量顯著提高。與同期非結(jié)合培養(yǎng)所產(chǎn)甲烷15.75%相比較，無論是N1 還是N2 的產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷結(jié)合后所產(chǎn)氣體中甲烷體積分?jǐn)?shù)均達(dá)到79%以上，產(chǎn)氣量也從25 mL 提高到50 和48 mL，提高了近1倍。最終計(jì)算每100 mL 產(chǎn)氫結(jié)合體系平均20 d 內(nèi)產(chǎn)甲烷總量1.75 mmol 遠(yuǎn)高于同期非結(jié)合培養(yǎng)的0.176 mmol。

表4 產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷結(jié)合培養(yǎng)20 d后不同樣品氣體組分Table 4 Gas components of different samples after 20 days of combined hydrogen production and methane production cultivation

輔酶F420是一類可以將化學(xué)基團(tuán)從一個(gè)酶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)酶上的有機(jī)小分子，可作為一個(gè)衡量厭氧污泥活性的測(cè)定指標(biāo)，可以反映污泥的產(chǎn)甲烷活性，各種甲烷菌中均含有輔酶F420，通過對(duì)發(fā)酵液中的輔酶F420含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷結(jié)合后產(chǎn)甲烷作用活性顯著升高，體系培養(yǎng)20 d 的發(fā)酵液中輔酶F420含量比同期非結(jié)合培養(yǎng)增加10 倍左右，這與甲烷產(chǎn)量的增長(zhǎng)呈正比（表5）。最終計(jì)算得出每100 mL 發(fā)酵液利用產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷結(jié)合的方法20 d 內(nèi)產(chǎn)甲烷的速率為0.087 5 mmol/d，是同期非結(jié)合培養(yǎng)0.008 8 mmol/d 的近10 倍，且兩階段培養(yǎng)下的甲烷轉(zhuǎn)化率達(dá)到28%，與N1、N2 污泥單一培養(yǎng)作用原油90 d 的產(chǎn)甲烷平均轉(zhuǎn)化率19.4%相比，得到顯著提升，結(jié)果表明產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷兩階段培養(yǎng)法，能夠大幅度提高微生物產(chǎn)甲烷速率，進(jìn)而提高甲烷轉(zhuǎn)化率，實(shí)現(xiàn)了利用產(chǎn)氫強(qiáng)化微生物作用原油產(chǎn)甲烷的效果。

表5 不同培養(yǎng)體系發(fā)酵液中輔酶F420Table 5 Coenzyme F420 in fermentation liquid in different cultivation systems

3 結(jié) 論

（1）來自大慶石化公司污水處理廠曝氣池底部的污泥樣品含有豐富的微生物種群，包括產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌，其濃度為103～106個(gè)/mL，在45 ℃培養(yǎng)條件下，分別接種在產(chǎn)氫培養(yǎng)和產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d 和90 d 后可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷的功能，為產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷兩階段結(jié)合培養(yǎng)提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。

（2） 所篩選的產(chǎn)氫菌，其產(chǎn)氫量可穩(wěn)定在0.8 mmol 左右。通過對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化，每100 mL發(fā)酵液所產(chǎn)氣體的總氫量達(dá)到1.63 mol，發(fā)酵液pH在1～2 d 內(nèi)顯著降低，揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量達(dá)到2 000 mg/L 以上，產(chǎn)生大量H2和CO2同時(shí)產(chǎn)生大量有機(jī)酸，為產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷兩階段結(jié)合培養(yǎng)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

（3）利用產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌的互營(yíng)代謝這一生物學(xué)特性，設(shè)計(jì)出產(chǎn)氫與產(chǎn)甲烷兩階段結(jié)合的方法，提高了產(chǎn)甲烷反應(yīng)速率，與普通的非結(jié)合產(chǎn)甲烷體系的產(chǎn)甲烷速率相對(duì)比，可使產(chǎn)甲烷的速率短時(shí)間20 d 內(nèi)提高近10 倍，達(dá)到0.087 5 mmol/d。打破了傳統(tǒng)由于氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷過程中作為前體物質(zhì)H2的缺乏從而導(dǎo)致產(chǎn)甲烷效率低的問題，有效地提高了產(chǎn)甲烷的反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率。