宏基因組二代測(cè)序技術(shù)在2型糖尿病合并肺部感染患者中的臨床應(yīng)用

牛凱 劉斌

糖尿病是臨床常見(jiàn)的慢性代謝性疾病,易并發(fā)感染,其中肺部感染約占糖尿病合并感染的45%,病死率可達(dá)41%[1]。糖尿病患者肺部感染的病原體種類繁多,不乏多重耐藥菌、真菌等[2-3],鑒別診斷較為困難,給臨床決策帶來(lái)極大困擾及挑戰(zhàn),因此確定其病原學(xué)尤為重要。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)靈敏度差,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),病原學(xué)覆蓋面窄[4],而宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic Next Generation Sequencing,mNGS)可早期、快速、精準(zhǔn)鑒定各種感染性疾病的病原學(xué)診斷,此外mNGS技術(shù)檢測(cè)到越來(lái)越多的罕見(jiàn)病原體,為部分重癥或疑難病例的診斷提供了一種快速有效的策略[5]。本研究回顧性的分析了糖尿病合并肺部感染患者的宏基因二代測(cè)序檢測(cè)的病原學(xué)結(jié)果,為mNGS的臨床應(yīng)用提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性收集2021年11月至2023年3月入住阜陽(yáng)市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的2型糖尿病合并肺部感染患者的臨床資料共103例,收集患者的臨床資料。病例入選標(biāo)準(zhǔn):均符合2021年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(American Diabetes Association,ADA) 制定的《糖尿病醫(yī)學(xué)診療標(biāo)準(zhǔn)》[6];納入的所有患者符合社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)[7]或醫(yī)院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia,HAP)[8]或重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],且患者簽署纖支鏡下肺泡灌洗術(shù)知情同意書及 NGS檢測(cè)知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患1型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病患者。(2)未成年人。(3)樣本未通過(guò)mNGS質(zhì)量控制。(4)結(jié)合臨床資料最終診斷為非肺部感染性疾病。(5)臨床資料及實(shí)驗(yàn)室資料不完整。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)阜陽(yáng)市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意(醫(yī)倫理審查[2022]14號(hào))。

二、研究方法

所有入組患者均留取肺泡灌洗液、痰液、外周血、胸水、肺組織等標(biāo)本至少2份,分別送檢mNGS和傳統(tǒng)培養(yǎng)。傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè):采用法國(guó)生物梅里埃生產(chǎn)的VITEK2 COMPACT檢測(cè)儀進(jìn)行病原體鑒定,并根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第 3 版)進(jìn)行相關(guān)操作。mNGS檢測(cè):所有標(biāo)本的mNGS由天津金匙醫(yī)學(xué)科技有限公司合肥實(shí)驗(yàn)室完成(執(zhí)業(yè)許可登記號(hào):PDY83828512011417P1202)。通過(guò)樣本處理、核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序、生物信息學(xué)分析以及結(jié)果解讀獲得mNGS檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果報(bào)告在樣本送檢后的48～72h內(nèi)獲得。因患者經(jīng)濟(jì)原因,本研究mNGS僅對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序,因此未將RNA病毒納入分析范圍。

三、檢測(cè)結(jié)果判讀

參考《中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》的推薦意見(jiàn)[9],并最終根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,結(jié)合序列數(shù)、化驗(yàn)指標(biāo)、影像學(xué)改變、臨床癥狀及體征及治療效果,鑒別定植菌及假陽(yáng)性結(jié)果,由經(jīng)驗(yàn)豐富的3位正高級(jí)職稱醫(yī)生進(jìn)行綜合判定,確定致病菌,并進(jìn)行資料的同步收集。

四、統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;計(jì)數(shù)資料使用n(%)表示,使用配對(duì)χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者基本特征

共103例患者,其中男性69 (66.9%)例,女性34 (33.1%)例,平均年齡(65.80±12.15)歲。有吸煙史的患者63 (61.2%)例;有飲酒史的患者有44 (42.7%)例;糖尿病病程10年以上的患者有38 (36.9%)例;有肺部基礎(chǔ)疾病的患者有43 (41.7%)例;糖化血紅蛋白(HbA1c)<7%的患者有25 (24.3%)例;HbA1c≥7%的患者78 (75.7%)例;有慢性心腦血管疾病的患者有42 (40.8%)例(見(jiàn)表1)。

表1 103例患者基本特征

二、兩種方法病原體檢出分布

103例臨床送檢樣本中有92例肺泡灌洗液,3例痰液,2例胸水,3例血液,3例組織。通過(guò)mNGS共檢出可供參考的病原體73種,其中細(xì)菌47種,真菌10種,病毒16種,其中細(xì)菌檢出率排前三位的是銅綠假單胞菌(16.94%)、鮑曼不動(dòng)桿菌(9.60%),嗜麥芽窄食單胞菌(9.03%)(見(jiàn)表2)。傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)共檢出病原體21種,其中細(xì)菌 16種,真菌5種;檢出率排前三位的是銅綠假單胞菌(25.00%)、鮑曼不動(dòng)桿菌(15.90%)、嗜麥芽窄食單胞菌(13.63%)(見(jiàn)表3)。同時(shí)通過(guò)mNGS檢出了罕見(jiàn)的致病病原體,如鸚鵡熱衣原體、惠普爾養(yǎng)障體、總狀毛霉等。

表2 mNGS檢測(cè)出的病原體分布

表3 傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)出的病原體分布

三、兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

入組的103例患者均行mNGS及傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè),mNGS檢測(cè)的陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性率(81.55%vs42.72%),兩種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.013,P<0.001)(見(jiàn)表4)。

表4 mNGS與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果

在40例兩種檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性的病例中,有5例檢測(cè)結(jié)果完全一致,28例部分一致,7例完全不一致(見(jiàn)圖1)。

圖1 mNGS與傳統(tǒng)方法的一致性

四、兩種方法檢出致病微生物的效能

根據(jù)最終臨床診斷,mNGS標(biāo)本中,76份確診最終病原體(40例細(xì)菌感染、13例結(jié)核分枝桿菌感染、16例曲霉菌感染、5例毛霉菌感染、1例肺孢子菌感染、1例甲流病毒感染);傳統(tǒng)病原學(xué)標(biāo)本中,42份確診最終病原體(31例細(xì)菌感染、6例白色念珠菌感染、5例曲霉菌感染)。mNGS對(duì)致病菌的明確率高于傳統(tǒng)病原檢測(cè)(73.78%vs40.77%,P<0.05),但是兩者一致性較差(Kappa=0.179<0.4),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.933,P<0.001)。以臨床最終診斷為金標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步計(jì)算兩種檢測(cè)方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(Positive predictive value,PPV)及陰性預(yù)測(cè)值(Negative predictive value,NPV),用以評(píng)估兩種方法的檢測(cè)效能。結(jié)果顯示,mNGS敏感度高(92.68%vs51.21%,χ2=31.110,P<0.001),但是特異度低(61.90%vs90.47%,χ2=4.725,P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 mNGS與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的診斷效能

五、mNGS在不同亞組檢測(cè)陽(yáng)性率對(duì)比

根據(jù)入組患者年齡,將≥60歲的患者分為老年組,<60歲分為非老年組;根據(jù)入組患者糖尿病病程,將患者分為糖尿病長(zhǎng)病程組(≥10年)與糖尿病非長(zhǎng)病程組(<10年);根據(jù)糖化血紅蛋白水平,將患者分為血糖控制良好組(HbA1c<7%)和血糖控制欠佳組(HbA1c≥7%);根據(jù)是否合并基礎(chǔ)肺疾病,將患者分為肺基礎(chǔ)疾病組和無(wú)肺基礎(chǔ)疾病組。

對(duì)各分組mNGS的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),老年組與非老年組(80.28%vs84.37%,P>0.05)、糖尿病長(zhǎng)病程組與糖尿病非長(zhǎng)病程組(78.94%vs83.07%,P>0.05)、血糖控制良好組與血糖控制欠佳組(88.00%vs79.48%,P>0.05)之間mNGS的檢測(cè)陽(yáng)性率之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,合并肺基礎(chǔ)疾病組與無(wú)肺基礎(chǔ)疾病組(93.02%vs73.33%,P<0.05)之間mNGS的檢測(cè)陽(yáng)性率之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表6)。

表6 mNGS在各亞組之間的陽(yáng)性率對(duì)比

討 論

糖尿病是一種臨床常見(jiàn)的慢性代謝性疾病,易并發(fā)各種感染,其中并發(fā)肺部感染的發(fā)生率高,是造成糖尿病患者主要死因之一[10]。對(duì)于此類患者最主要的問(wèn)題是如何找到病原學(xué),從而對(duì)臨床抗感染治療提供幫助,進(jìn)一步提高治療效果,減少死亡率,而傳統(tǒng)檢測(cè)方法有其局限性,mNGS以快速、精準(zhǔn)、陽(yáng)性率高等優(yōu)勢(shì),進(jìn)一步在感染性疾病中,起到了重要的作用。

本次檢出的致病微生物中革蘭氏陰性菌在致病菌中占比高,mNGS的陽(yáng)性檢出率明顯高于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)(81.55%vs42.72%,P<0.05),與先前國(guó)內(nèi)研究一致[11-12]。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn),革蘭氏陰性菌中較常見(jiàn)的致病菌有銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等,革蘭氏陽(yáng)性菌中金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌較為多見(jiàn),真菌中曲霉菌多見(jiàn),病毒感染中人類皰疹病毒常見(jiàn)。在所有檢出中,嗜麥芽窄食單胞菌及結(jié)核分枝桿菌占比相對(duì)較高,這與他人的研究存在差異。觀察發(fā)現(xiàn),在16例檢出嗜麥芽窄食單胞菌的患者中,有8例診斷為重癥肺炎接受RICU治療,5例既往合并2種及以上基礎(chǔ)疾病,大大增加了醫(yī)院獲得性感染風(fēng)險(xiǎn)[13]。此外,結(jié)核分枝桿菌在免疫低下人群中才易發(fā)展為結(jié)核病,而糖尿病患者由于體內(nèi)多項(xiàng)代謝紊亂對(duì)人體免疫功能造成影響,增加了其結(jié)核易感性[14]。

在糖尿病合并肺部感染患者中mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的一致性較差,僅有5例檢測(cè)到的病原體完全一致,主要為銅綠假單胞菌、馬紅球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、煙曲霉。分析二者一致性較差可能的原因有:(1)mNGS有更廣泛的病原檢測(cè)譜,對(duì)特殊病原體如曲霉、毛霉、耶氏肺孢子菌、分枝桿菌等具有檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。(2)mNGS送檢樣本在收集、操作過(guò)程中有污染的可能性。因此,對(duì)mNGS檢測(cè)報(bào)告的解讀應(yīng)與臨床實(shí)際相結(jié)合。44例傳統(tǒng)檢測(cè)陰性但mNGS檢測(cè)陽(yáng)性,相比之下,在傳統(tǒng)培養(yǎng)無(wú)法檢測(cè)到的病原體,mNGS檢測(cè)具有較高的臨床價(jià)值。此外,有15例傳統(tǒng)檢測(cè)及mNGS檢測(cè)結(jié)果均陰性,考慮可能原因有:(1)部分患者行病原學(xué)檢測(cè)之前使用抗生素治療,可能影響病原體的檢出率。(2)所有mNGS標(biāo)本均送至第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu),延長(zhǎng)了上機(jī)時(shí)間,對(duì)病原體的檢出有影響。

為進(jìn)一步了解 mNGS的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值,本研究以臨床最終診斷為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),mNGS的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為92.68%、61.90%、90.47%、68.42%。其中mNGS檢測(cè)的敏感度高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,但特異度較低,這與既往部分研究結(jié)果相似[15-16]。此外,Li等[17]研究發(fā)現(xiàn),mNGS對(duì)肺部感染診斷的敏感度高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,特別是對(duì)細(xì)菌感染、混合感染、病毒感染和肺孢子蟲感染的檢出率明顯較高。本研究中,mNGS的特異度相對(duì)較低,主要是因?yàn)楸狙芯恳宰罱K臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合臨床實(shí)際判讀導(dǎo)致mNGS的假陽(yáng)性率增高,從而使得 mNGS的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值相對(duì)降低。本研究還表明,兩種檢測(cè)方法在鑒定特定真菌感染方面均有其各自的優(yōu)勢(shì),如在本研究中,傳統(tǒng)檢測(cè)方法在檢測(cè)白色念珠菌及熱帶念珠菌方面顯示出一定優(yōu)勢(shì),而mNGS在曲霉屬、毛霉屬的檢出率更高。既往研究表明,糖尿病是曲霉、毛霉等發(fā)病的危險(xiǎn)因素[18],對(duì)于高度懷疑這幾類真菌感染的患者,傳統(tǒng)檢測(cè)方法往往難以檢測(cè)到或回報(bào)結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng),及早行mNGS檢測(cè),有利于及時(shí)調(diào)整抗感染方案[19]。

分組研究發(fā)現(xiàn),在老年組與非老年組(80.28%vs84.37%,P>0.05)、糖尿病長(zhǎng)病程組與糖尿病非長(zhǎng)病程組(78.94%vs83.07%,P>0.05)、血糖控制良好組與血糖控制欠佳組(88.00%vs79.48%,P>0.05)mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)明顯差異,但合并肺基礎(chǔ)疾病組與無(wú)肺基礎(chǔ)疾病組(93.02%vs73.33%,P<0.05)mNGS的檢測(cè)陽(yáng)性率之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,進(jìn)一步表明mNGS對(duì)合并肺基礎(chǔ)疾病的肺部感染患者病原學(xué)檢出有較高的臨床價(jià)值。但由于本研究樣本量較少,仍需較大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究亦存在一定的局限性。首先,本研究為單中心回顧性研究,樣本量較小,進(jìn)一步需要多中心、大樣本、前瞻性臨床研究評(píng)估m(xù)NGS在2型糖尿病合并肺部感染患者中的應(yīng)用價(jià)值。其次,本研究未對(duì)mNGS結(jié)果對(duì)臨床最終治療決策的影響進(jìn)行評(píng)估。最后,本研究納入的均為進(jìn)行過(guò)mNGS檢測(cè)的肺部感染患者,而臨床中尚有大部分患者因經(jīng)濟(jì)情況未行mNGS檢測(cè),故研究本身存在設(shè)計(jì)上的偏倚,導(dǎo)致感染類型納入并非全面。

綜上所述,mNGS檢測(cè)在檢出陽(yáng)性率方面優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,尤其是在真菌、病毒、特殊病原體方面。mNGS也有相應(yīng)的不足,現(xiàn)階段仍不能替代傳統(tǒng)臨床診斷檢測(cè)方法。但在臨床病原學(xué)檢測(cè)中,可以作為傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)的有效補(bǔ)充,對(duì)于肺部感染病因難以判斷或治療效果欠佳的患者,建議盡早行mNGS及傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè),進(jìn)一步行針對(duì)性治療。