miR-134-5p、miR-34a、CCL20預(yù)測肺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的價值

李靜 李志娜 田浩印 李萬剛 李楊

非小細(xì)胞肺癌 (non small cell lung cancer,NSCLC)為常見的肺癌類型,死亡率較高[1]。其病因主要有吸煙、遺傳、電離輻射及大氣污染等[2]。早期表現(xiàn)為胸部脹痛、痰血、低熱及咳嗽等,晚期則伴有乏力、呼吸困難及咯血等癥狀[3]。首選外科手術(shù)對其治療,但術(shù)后仍有大量患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā),預(yù)后欠佳[4]。因此,尋找可精確預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的血清指標(biāo),對預(yù)后判斷和術(shù)后輔助治療的選擇意義較大。血清微小核糖核酸-134-5p(miRNA-134-5p,miR-134-5p)位于14號染色體,是非編碼調(diào)控RNA,參與細(xì)胞發(fā)育、分化等,與腫瘤等疾病關(guān)系密切[5]。趨化因子20(chemokine20,CCL20)基因位于2q36.3,參與免疫調(diào)節(jié)[6]。研究表明[7],CCL20可影響肺癌等腫瘤的發(fā)生,其對腫瘤免疫反應(yīng)起到抑制作用,促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展。血清微小核糖核酸-34a(miRNA-34a,miR-34a)可影響血管生成,在大量惡性腫瘤中異常表達(dá),如結(jié)腸癌、肺癌等[8]。因此本研究探討NSCLC患者血清miR-134-5p、CCL20及miR-34a表達(dá)情況,分析三者對NSCLC患者肺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。

資料與方法

一、一般資料

1 選取河北中石油中心醫(yī)院2018年1月—2020年1月收治的符合條件的90例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者作為研究對象,所有患者均在我院接受胸腔鏡下肺癌根治術(shù)治療,術(shù)后接受24個月的電話或門診隨診檢查,經(jīng)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)與原發(fā)病灶有關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶或肺部出現(xiàn)新的癌癥病灶,其中出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者61例(復(fù)發(fā)組)、未出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者29例(對照組)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者年齡范圍19～79歲。(2)NSCLC患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《CSCO 2015年肺癌診療指南》[9]中關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。(3)所有NSCLC患者均為初診患者,在我院接受根治性手術(shù)治療,術(shù)后愿意接受隨訪觀察。(4)術(shù)前經(jīng)胸部CT、MRI檢查證實病情,術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實。(5)患者術(shù)前纖維支氣管鏡取活組織病檢或術(shù)后病理學(xué)檢查:TNM分期Ⅰ～Ⅲ期。(6)研究方案符合醫(yī)學(xué)倫理委員會規(guī)定(KYLL-2022-16),并獲得研究對象及其家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者或既往有放化療病史。(2)合并嚴(yán)重的肺部其他類型基礎(chǔ)疾病(肺栓塞、肺纖維化、矽肺、支氣管哮喘等)。(3)伴有嚴(yán)重心衰(NYHA)≥Ⅲ級、急性心肌梗死、腦血管疾病。(4)合并其他系統(tǒng)的重大疾病等。

2 指標(biāo)檢測方法 CCL20檢測:采集復(fù)發(fā)組及對照組術(shù)前1周以內(nèi)的空腹靜脈血5 mL,采用EDTA對血液進(jìn)行抗凝,離心半徑10 cm,以2500 r/min的速度進(jìn)行離心10 min,取上清液,保存在-20℃的冰箱內(nèi)待檢。采用ELISA法檢測血清CCL20,按試劑盒說明操作。采用美國賽默飛 Multiskan Ascent型酶標(biāo)儀對血清樣品450nm處吸光度值進(jìn)行檢測,計算相應(yīng)樣品的濃度。血清miR-134-5p檢測,采集復(fù)發(fā)組及對照組術(shù)前空腹靜脈血5mL,采用Trizol法提取兩組血清總RNA,用40 μL DEPC水溶解。當(dāng)260nm與280nm處的吸光度比值為1.8～2.1時,表明合格。采用熒光定量PCR法對miR-134-5p表達(dá)量進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系:包括cDNA 2 μL,上下游引物各0.5μL,2×SYBRGreenmix10 μL,無RNA酶水7 μL。以U6為內(nèi)參,用2-ΔΔct法對miR-134-5p相對表達(dá)量進(jìn)行計算。采用RT-PCR法檢測miR-34a相對表達(dá)量,采集復(fù)發(fā)組及對照組術(shù)前空腹靜脈血5mL,保存于抗凝管內(nèi),以3000 r/min的速度離心,離心時間為10 min,半徑10 cm。取上清液,于-80°冰箱內(nèi)保存。用試劑盒提取血清內(nèi)總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以此cDNA為模板行PCR擴(kuò)增。采用2-ΔΔct計算miR-34a標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)水平。肺癌TNM分期[10]為:T表示原發(fā)腫瘤大小,N表示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,M表示肺癌有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。依據(jù)情況分成Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。Ⅰ期:腫瘤≤5 cm,且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ⅱ期:腫瘤為5～7 cm,但不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,或僅有N1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ⅲ期:腫瘤伴有N1、N2或N3淋巴轉(zhuǎn)移。Ⅳ期:患有肺癌后沒有正確治療,只要發(fā)生癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,即為Ⅳ期肺癌,即晚期肺癌。

二、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平比較

復(fù)發(fā)組患者術(shù)前的血清miR-134-5p水平顯著低于對照組(P<0.05),復(fù)發(fā)組患者術(shù)前血清miR-34a和CCL20水平顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平比較

二、術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20預(yù)測NSCLC患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)的價值

以術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平作為預(yù)測變量繪制ROC曲線,結(jié)果顯示術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20預(yù)測NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積AUC值分別為0.783(95%CI:0.670～0.897)、0.656(95%CI:0.537～0.775)、0.675(95%CI:0.563～0.787)(P均<0.05),說明其具有一定的預(yù)測價值(圖1)。

圖1 A:術(shù)前血清miR-34a、CCL20水平預(yù)測NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線;B:術(shù)前血清miR-134-5p水平預(yù)測NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

三、兩組患者一般臨床資料比較

對比復(fù)發(fā)組患者和對照組患者的年齡、BMI、吸煙、飲酒、性別、合并疾病、肺癌家族史等情況,兩組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

四、兩組患者病理學(xué)特征及部分實驗室指標(biāo)比較

復(fù)發(fā)組TNM分期≥Ⅱ期患者占比75.41%,高于對照組的51.72%,復(fù)發(fā)組患者腫瘤低分化患者占比42.62%高于對照組的17.24%,復(fù)發(fā)組患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占比62.30%,高于對照組37.93%,復(fù)發(fā)組患者切緣陽性患者45.90%高于對照組的20.69%,上述指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 兩組患者病理學(xué)特征及部分實驗室指標(biāo)比較[n(%)]

五、miR-134-5p、miR-34a、CCL20與NSCLC患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素分析

以NSCLC患者的TNM分期(<Ⅱ期=0,≥Ⅱ期=1)、腫瘤低分化程度(高+中分化=0,低分化=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(否=0,是=1)、切緣陽性情況(否=0,是=1)、血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平作為自變量,以患者是否發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)作為因變量(否=0,是=1),Logistic結(jié)果顯示:NSCLC患者術(shù)前miR-134-5p降低、miR-34a增高、CCL20增高、TNM分期≥Ⅱ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性是其術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)(表4)。

表4 Logistic回歸因素模型

討 論

NSCLC在肺癌中占比極高,其發(fā)病率高、死亡率高且預(yù)后差[11]。其主要受遺傳、大氣環(huán)境及不良生活習(xí)慣所影響[12]。其早期有胸痛、咳嗽、咳痰等表現(xiàn),晚期常表現(xiàn)為咯血、呼吸困難等癥狀[13]。臨床常用手術(shù)對其治療,但術(shù)后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā),預(yù)后欠佳。為此,臨床亟待尋找可精確評估術(shù)后療效的預(yù)測指標(biāo)。miR-134-5p參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,可反映病程進(jìn)展[14]。CCL20參與炎癥及免疫調(diào)節(jié)過程,其經(jīng)過促進(jìn)髓源性抑制細(xì)胞等細(xì)胞的作用,對腫瘤免疫反應(yīng)進(jìn)行抑制[15]。miR-34a可在肺癌等多數(shù)惡性腫瘤內(nèi)異常表達(dá)[16]。因此本研究采用三者對NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值進(jìn)行探究。

本研究結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)組患者術(shù)前的血清miR-134-5p水平顯著低于對照組,復(fù)發(fā)組患者術(shù)前血清miR-34a、CCL20水平顯著高于對照組。術(shù)前血清 CCL20含量顯著高于對照組,說明血清CCL20高表達(dá)的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的可能性較高。CCL20為巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α,是小細(xì)胞因子CC基因的亞家族[17]。當(dāng)腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)時,會造成其水平增高,因此其可作為預(yù)測NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵血清指標(biāo)[18]。miRNA是非編碼RNA分子,主要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄來調(diào)控基因表達(dá),在腫瘤、免疫及感染等多種疾病中發(fā)揮作用。miR-134-5p于肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤內(nèi)異常表達(dá),可經(jīng)過調(diào)控抑癌基因表達(dá),進(jìn)而對腫瘤發(fā)生發(fā)展造成影響。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組血清 miR-134-5p相對表達(dá)量比對照組顯著降低,可能受miR-134-5p表觀遺傳學(xué)修飾影響。有研究[19]表明,長鏈非編碼RNA可經(jīng)過甲基化修飾,抑制miR-134-5p表達(dá),致使細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促使腫瘤惡性發(fā)展[20]。miR-34a為是 miR-34家族中一員,共有22個堿基,此基因定位1p36.23 上,與細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)。研究表明[21]miR-34a可負(fù)向調(diào)控蛋白表達(dá),阻止癌細(xì)胞生長、增殖。本研究顯示,復(fù)發(fā)組患者血清中miR-34a呈高表達(dá),提示其可作為評估NSCLC復(fù)發(fā)的腫瘤指標(biāo)。本研究結(jié)果表明,術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20預(yù)測NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積AUC值分別為0.783、0.656、0.675,說明術(shù)前血清miR-134-5p檢測對NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值較高,可作為評估術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵血清指標(biāo)。

本研究對兩組患者的病理學(xué)特征及部分實驗室指標(biāo)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)組TNM分期≥Ⅱ期患者占比、腫瘤低分化患者占比、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占比、切緣陽性患者占比均高于對照組。進(jìn)一步的多因素回歸分析結(jié)果顯示NSCLC患者術(shù)前miR-134-5p降低、miR-34a增高、CCL20增高、TNM分期≥Ⅱ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性是其術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素。低分化相比于中高分化的腫瘤惡性程度高,因此復(fù)發(fā)率相對較高[22]。TNM分期是應(yīng)用最為廣泛的肺癌分期方法,TNM分期越高,腫瘤進(jìn)展程度越高,越容易復(fù)發(fā)。NSCLC主要依靠淋巴系統(tǒng)和血液進(jìn)行轉(zhuǎn)移,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移同樣提示腫瘤進(jìn)展程度較高,因此淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素[23]。Logistic回歸分析的結(jié)果進(jìn)一步說明了miR-134-5p、miR-34a、CCL20與NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。miR-134-5p可抑制癌基因表達(dá),腫瘤出現(xiàn)時miR-134-5p下調(diào)可造成BTG-2高表達(dá),致使腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[24]。有研究表明[25],術(shù)前血清miR-34a高表達(dá)可以使腫瘤增殖分化,是肺癌患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)的危險因素之一,同樣說明患者術(shù)前血清miR-34a表達(dá)量的檢測有利于評估復(fù)發(fā)及預(yù)后狀況。

綜上所述,術(shù)前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20預(yù)測NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)有一定的價值,miR-134-5p價值更高,且均與患者術(shù)后復(fù)發(fā)具有密切關(guān)系。