馮鞏,徐燁,趙旭,馮其金

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)

脊柱側(cè)彎是脊柱的非正常彎曲,是一種脊柱的三維畸形,包括冠狀位、矢狀位和軸位上的序列異常[1]。脊柱側(cè)彎可分為早發(fā)性脊柱側(cè)彎[2]、青少年脊柱側(cè)彎[3]以及成人脊柱側(cè)彎[4],其具體病因尚未完全明確,可能與基因遺傳[5]、內(nèi)分泌[6]、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)病變[7]等因素有關(guān)。脊柱側(cè)彎的治療方法因側(cè)彎的嚴(yán)重程度而異,輕度脊柱側(cè)彎通常采用佩戴支具、按摩及功能鍛煉等方法進(jìn)行矯正,而對于Cobb角≥40°的脊柱側(cè)彎則建議手術(shù)治療,但一次手術(shù)難以達(dá)到預(yù)期效果,通常需要翻修手術(shù)[8]。為明確脊柱側(cè)彎的發(fā)病原因以及尋找更好的治療方法,研究者們建立了各種脊柱側(cè)彎動物模型。本文就脊柱側(cè)彎動物模型制備方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期為脊柱側(cè)彎的相關(guān)研究提供參考。

1 手術(shù)機(jī)械類模型制備

目前通過手術(shù)內(nèi)固定制備脊柱側(cè)彎模型已經(jīng)相對成熟[9]。通過四足動物制備手術(shù)機(jī)械類脊柱側(cè)彎模型的操作方法主要包括:①切除肋骨;②椎骨或肋骨相互固定。上述方法均在不改變椎體本身結(jié)構(gòu)的情況下,使脊柱或支撐組織失去平衡,在此類動物模型中脊柱側(cè)彎的進(jìn)展同脊柱側(cè)彎患者的病情進(jìn)展一致。長期平臥的人類可以出現(xiàn)脊柱側(cè)彎[10],表明重力不是脊柱側(cè)彎發(fā)病的先決條件,所以四足動物脊柱側(cè)彎模型的制備具有一定的科學(xué)性。Meiring等[11]研究認(rèn)為,通過切除對側(cè)肋骨及椎弓根螺釘固定能誘發(fā)特發(fā)性脊柱畸形。Sunni等[12]通過研究發(fā)現(xiàn),對牛脊柱進(jìn)行椎體融合術(shù)后,可使牛的Cobb角增加約30°,而且還發(fā)現(xiàn)牛椎體骺板均有不同程度的損傷,說明過大的應(yīng)力在增加Cobb角的同時會損傷脊柱。Gross等[13]對實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行了如下手術(shù)操作:①于T10～T11左側(cè)開胸;②于T9和T11放置螺釘;③T10椎體部分切除;④橫斷棘間韌帶;⑤螺釘周圍放置鋼絲圈并擰緊。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),術(shù)后即刻6只豬的Cobb角為30.5°±1.0°,術(shù)后5周內(nèi)Cobb角不斷增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時Cobb角為50.3°±7.2°。出現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因可能是豬的體重不斷增加(實(shí)驗(yàn)豬初始體質(zhì)量約為10 kg,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時體質(zhì)量約為25 kg),此觀點(diǎn)與Laubach等[14]的觀點(diǎn)一致。此外,通過支具外固定也能制備脊柱側(cè)彎動物模型。Banala等[15]用支具外固定小鼠脊柱5周后,發(fā)現(xiàn)小鼠Cobb角約為50°,而摘除支具后7周,小鼠的Cobb角卻減小了10°～20°。

綜上所述,通過內(nèi)固定和支具外固定都能制備脊柱側(cè)彎動物模型,內(nèi)固定能夠形成長期穩(wěn)定的Cobb角,缺點(diǎn)是會損傷實(shí)驗(yàn)動物,制備成本高,對個體較小的實(shí)驗(yàn)動物操作較難;支具外固定的優(yōu)勢在于方便經(jīng)濟(jì),劣勢在于實(shí)驗(yàn)后形成的Cobb角在支具撤離的一段時間后會減小。

2 基因類模型制備

隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展,脊柱側(cè)彎遺傳學(xué)相關(guān)研究迅速增加。目前已知與脊柱側(cè)彎相關(guān)的基因包括TBX6、NPR2、ZMYND10、BNC52、POC5、ZIC3、NKAP等[16]。盡管越來越多的研究發(fā)現(xiàn)脊柱側(cè)彎與遺傳變異有關(guān),但其潛在的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。通過基因編輯建立動物模型,可觀察脊柱發(fā)育過程中存在一系列分子生物學(xué)的異常,進(jìn)而確定遺傳因素在脊柱側(cè)彎發(fā)病機(jī)制中的作用。

脊柱的發(fā)育方式主要為軟骨內(nèi)成骨。骨軟骨病樣變化可導(dǎo)致豬脊柱出現(xiàn)后凸,因此通過誘導(dǎo)骨軟骨病樣變化,能夠制備與軟骨相關(guān)的脊柱側(cè)彎基因模型[17]。Halanski等[18]通過減少山羊母體維生素D的攝取,發(fā)現(xiàn)其后代也出現(xiàn)了脊柱側(cè)彎。TAQL(RS731236)基因以及維生素D受體均參與維生素D的代謝途徑,因此誘導(dǎo)維生素D作用路徑相關(guān)基因突變,可使脊柱發(fā)生側(cè)彎。Isaac等[19]以抗肌萎縮蛋白、肌營養(yǎng)不良蛋白雙敲除小鼠作為肌肉骨骼過早老化模型,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)小鼠的骨礦物質(zhì)密度和含量均顯著降低,此現(xiàn)象同杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥患者的表現(xiàn)一致。從基因水平上抑制鈣離子攝取以及減緩成骨細(xì)胞活躍性是造成脊柱強(qiáng)度不均而發(fā)生側(cè)彎的一個重要途徑。此外,肌萎縮蛋白缺乏可引起肌肉萎縮,同時也可導(dǎo)致骨質(zhì)流失,誘發(fā)退行性脊柱側(cè)彎[20]。故影響鈣離子跨膜吸收相關(guān)基因CABP-D9K、TRPV6的表達(dá),可減少實(shí)驗(yàn)動物胃腸道對鈣離子的吸收,減弱脊柱抗應(yīng)力的能力,使椎體發(fā)生移位而形成側(cè)彎。

SAMP8小鼠是一種快速老化小鼠,是研究退行性脊柱側(cè)彎的理想動物模型。Hu等[21]通過麻醉下截?cái)郤AMP8小鼠的前肢及尾巴來模擬人直立行走的實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠的椎間盤發(fā)生了退變,包括椎間盤高度的減少和椎骨骨贅的形成,而且SAMP8小鼠發(fā)生脊柱側(cè)彎率為100%。這說明衰老、椎間盤退化及椎體骨贅的形成與退行性脊柱側(cè)彎的發(fā)生有一定的潛在關(guān)系。以上模型能為脊柱側(cè)彎基因方面的研究提供幫助,但不同基因模型可重復(fù)率有差異,且基因編碼動物較普通實(shí)驗(yàn)動物昂貴。

3 神經(jīng)肌肉類模型制備

神經(jīng)元異常在神經(jīng)肌肉性脊柱側(cè)彎中起著重要作用[22],Van Gennip等[23]通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該觀點(diǎn)。Assaraf等[24]的研究結(jié)果顯示,神經(jīng)元中缺乏piezo2的小鼠患脊柱側(cè)彎的概率高于正常小鼠。Kamal等[25]對雷諾綜合征小鼠進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),小鼠的骨剛度和骨負(fù)荷降低以及神經(jīng)元異常可導(dǎo)致脊柱兩側(cè)的力學(xué)分布存在差異。在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎患者中,神經(jīng)炎癥和氧化過激也扮演著重要角色。sspO蛋白是一種高分子糖蛋白,參與低密度脂蛋白識別。該蛋白與低密度脂蛋白對神經(jīng)起到調(diào)節(jié)作用,sspO 蛋白缺乏能夠誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥。Rose等[26]通過對斑馬魚使用sspO表達(dá)抑制劑,制備出了斑馬魚脊柱側(cè)彎模型。

肌肉的力學(xué)特性對人體力量的生成和控制發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。肌肉力學(xué)失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致脊柱側(cè)彎的原因之一[27]。脊柱兩旁的肌肉力學(xué)平衡維持著脊柱的正常形態(tài),當(dāng)一側(cè)肌肉過度牽拉或萎縮,脊柱雙側(cè)力學(xué)就會失衡,從而發(fā)生脊柱側(cè)彎。Xie等[28]研究發(fā)現(xiàn),脊柱雙側(cè)肌肉的生物力學(xué)特征與肌肉纖維和膠原分布的差異相關(guān)。剝離實(shí)驗(yàn)動物單側(cè)椎旁肌來模擬脊椎雙側(cè)力學(xué)失衡,可制備出符合條件的脊柱側(cè)彎動物模型。該模型制備過程簡易,但需注意肌肉剝離過程中對神經(jīng)的損傷。杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥是由功能性肌營養(yǎng)不良蛋白喪失引起的,其特征是肌纖維肌膜缺乏抗肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá),該病與75%～90%的脊柱側(cè)彎有關(guān)。Isaac等[19]以抗肌萎縮蛋白、肌營養(yǎng)不良蛋白雙敲除小鼠和C57BL/10小鼠為研究對象,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種小鼠均出現(xiàn)明顯的脊柱側(cè)彎,但前一種小鼠發(fā)生側(cè)彎的比例高于后一種小鼠,且側(cè)彎的角度也大于后一種小鼠。Wang等[29]通過對C57BL/6小鼠腹部注射地塞米松后發(fā)現(xiàn),注射地塞米松的小鼠比正常小鼠體重減輕了15.7%,而其全身脂肪含量較正常小鼠更高。地塞米松能誘導(dǎo)小鼠肌肉發(fā)育不良,對小鼠局部注射地塞米松可使小鼠脊柱兩側(cè)力學(xué)失衡而出現(xiàn)側(cè)彎。

此類模型同手術(shù)機(jī)械類模型相似,均可直接改變脊柱兩側(cè)力學(xué),其優(yōu)點(diǎn)在于能夠驗(yàn)證側(cè)彎發(fā)生的原因,可重復(fù)性較強(qiáng),而手術(shù)機(jī)械類模型則多用于脊柱側(cè)彎治療方法的療效評價。

4 內(nèi)分泌類模型制備

1959年,Thillard首次報(bào)道切除雞體內(nèi)松果體可制造出與人類脊柱側(cè)彎解剖特征類似的脊柱畸形[30]。此后許多研究者提出褪黑素的合成和代謝缺陷是導(dǎo)致脊柱側(cè)彎的關(guān)鍵因素。目前已有研究表明,褪黑素缺乏與青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[31]。褪黑素是松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素[32]。切除雞體內(nèi)松果體是一種早期脊柱側(cè)彎動物模型的制備方法。目前缺乏褪黑素的C57BL/6J小鼠是另一種理想的脊柱側(cè)彎動物模型,該模型的優(yōu)點(diǎn)在于血清素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(該酶在褪黑素的合成中必不可少)基因的自然敲除,而無需切除松果體[33]。Liu等[34]對C57BL/6J小鼠進(jìn)行外源性褪黑素干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)15周時約90%的C57BL/6J小鼠出現(xiàn)了脊柱側(cè)彎,Cobb角平均約為21°,而接受褪黑素治療的小鼠僅有約5%的小鼠出現(xiàn)了脊柱側(cè)彎;在干預(yù)20周時未接受褪黑素治療的小鼠骨小梁間距明顯寬于接受褪黑素治療的小鼠,但2組小鼠骨小梁數(shù)量并未有明顯差異。由此可推測,褪黑素可通過改變骨小梁之間的間距來影響骨強(qiáng)度,進(jìn)而誘發(fā)脊柱側(cè)彎。Yang等[35]對雙足大鼠腹部注射褪黑素拮抗劑Luzindole,經(jīng)過6個月的實(shí)驗(yàn)觀察,發(fā)現(xiàn)使用Luzindole的雙足大鼠脊柱側(cè)彎率及側(cè)彎程度均高于未使用Luzindole的雙足大鼠;但對正常大鼠使用Luzindole后,并未出現(xiàn)明顯側(cè)彎。這表明單純褪黑素缺乏并不能直接使脊柱發(fā)生側(cè)彎。除褪黑素外,較低水平的雄激素也能影響女性青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎患者的軟骨發(fā)育,異常的軟骨發(fā)育會加劇脊柱側(cè)彎進(jìn)程[36]。在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎患者中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路中SPRY4基因下調(diào)最嚴(yán)重[37],SPRY4基因可在褪黑素作用下上調(diào),并以EK-ERK1/2依賴性方式促進(jìn)成骨分化和褪黑素反應(yīng)。對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行SPRY4基因敲除或注射SPRY4抗體,可使MAPK信號通路中SPRY4基因下調(diào),破壞成骨分化,使脊柱出現(xiàn)側(cè)彎。

5 小 結(jié)

手術(shù)機(jī)械類動物模型制備的可重復(fù)性強(qiáng),適合新型內(nèi)外固定方法治療脊柱側(cè)彎的研究,但在制備過程中應(yīng)嚴(yán)格把控初始Cobb角;基因類動物模型制備成本較高,但能為脊柱側(cè)彎基因方面的研究提供幫助;神經(jīng)肌肉類動物模型制備的可重復(fù)性也較強(qiáng),能驗(yàn)證脊柱側(cè)彎發(fā)生的原因;內(nèi)分泌類動物模型更適合藥物治療脊柱側(cè)彎的研究。相信隨著科學(xué)的不斷進(jìn)步,脊柱側(cè)彎模型的制備方法將會不斷完善,脊柱側(cè)彎的發(fā)病機(jī)制也將更加清晰。