雙膦酸鹽類藥物對區(qū)域骨代謝加速過程中巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響

郭珍珍 程筠 黃文霞

雙膦酸鹽(bisphosphonates, Bps)類藥物是一類化學(xué)合成藥物, 主要作用于骨組織并影響骨代謝, 在臨床中主要應(yīng)用于抗代謝骨病, 如骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤引發(fā)的高鈣血癥和骨痛癥等［1,2］。近年來, 雙膦酸鹽類藥物在癌癥患者中預(yù)防癌癥骨轉(zhuǎn)移的應(yīng)用逐漸增多, 與此同時(shí), 與雙膦酸鹽類藥物相關(guān)的區(qū)域骨代謝加速的報(bào)道也逐漸增多。由雙膦酸鹽引起的頜骨壞死(bisphosphonates-related osteonecrosis of jaw, BRONJ) 的機(jī)制尚不完全清楚, 對于雙膦酸鹽類藥物相關(guān)性區(qū)域骨代謝加速的治療以及預(yù)防都還需要進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇40 只雌性SD 大鼠, 體重(200±20) g, 購自于斯貝(北京)生物技術(shù)有限公司, 獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號。將大鼠隨機(jī)分為空白對照組、ZA 組、IL-17 組、laq 組, 每組10 只。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 雙膦酸鹽類藥物(唑來膦酸)、Micro CT、X 射線牙機(jī)片、3%過氧化氫溶液、4%多聚甲醛、PBS、3% BSA、兔抗大鼠CD68 抗體、兔抗大鼠INOS 抗體、兔抗大鼠CD206、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、大鼠抗鼠IL-17 單克隆抗體、拉喹莫德。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 ZA 組、IL-17 組、laq 組腹腔注射唑來膦酸建立動(dòng)物模型, 空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。對四組大鼠行頜骨拔牙術(shù), IL-17 組大鼠給予抗大鼠IL-17 中和抗體, laq 組大鼠給予拉喹莫德。拔牙術(shù)后第8 周處死大鼠, 取完整骨固定, 實(shí)施X 線檢查與Micro-CT 掃描, 分析其骨代謝情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立

2.1.1 拔牙創(chuàng)愈合情況 空白對照組大鼠拔牙創(chuàng)愈合情況良好, 無死骨形成, 骨代謝尚可。見圖1A。ZA 組、IL-17 組、laq 組大鼠均發(fā)生了不同程度的黏膜愈合不良, 骨面暴露, 拔牙創(chuàng)延遲愈合, 拔牙窩空虛。見圖1B。

2.1.2 骨代謝情況 空白對照組BRONJ 發(fā)病率為0(0/10), ZA 組為80%(8/10), IL-17 組為30%(3/10), laq組為60%(6/10), IL-17 組、laq 組較ZA 組的發(fā)病率呈現(xiàn)了下降的趨勢。見圖2A。ZA 組、IL-17 組和laq 組大鼠拔牙創(chuàng)部位的BV/TV 均明顯低于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明ZA 組、IL-17 組和laq 組大鼠骨代謝較快。見圖2B。

圖2 四組大鼠骨代謝情況

2.2 骨密度情況 X 線片與Micro-CT 檢查顯示BRONJ 大鼠拔牙創(chuàng)出現(xiàn)明顯骨密度降低, 拔牙窩空虛,拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨不良并伴有死骨形成；空白對照組中的大鼠頜骨黏膜愈合良好, 骨密度正常, 骨代謝穩(wěn)定。見圖3。

圖3 大鼠頜骨影像學(xué)檢查

2.3 唑來膦酸有助于巨噬細(xì)胞向M1 型極化, 阻斷或抑制IL-17 活性可抑制巨噬細(xì)胞向M1 型細(xì)胞極化相比于空白對照組大鼠, BRONJ 大鼠中觀察到大量CD68+巨噬細(xì)胞浸潤, 同時(shí), iNOS+巨噬細(xì)胞也大量出現(xiàn), 而CD206+巨噬細(xì)胞卻呈現(xiàn)了明顯降低的趨勢。ZA組、IL-17 組和laq 組中的CD68+巨噬細(xì)胞、iNOS+巨噬細(xì)胞、CD206+巨噬細(xì)胞的表達(dá)量均與空白對照組呈現(xiàn)出明顯差異；ZA 組分別與IL-17 組和laq 組相比較,3 種細(xì)胞的數(shù)量也呈現(xiàn)差異, 說明唑來膦酸不僅引起大量巨噬細(xì)胞的浸潤, 還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型細(xì)胞極化；阻斷或抑制IL-17 活性能夠減少巨噬細(xì)胞浸潤,并抑制巨噬細(xì)胞向M1 型細(xì)胞極化；相比較空白對照組大鼠, 在BRONJ 大鼠中iNOS 陽性巨噬細(xì)胞明顯占優(yōu)勢, M1 型細(xì)胞與 M2 型細(xì)胞的比例更為凸顯, 說明M1 型巨噬細(xì)胞在大鼠形成BRONJ 的過程中具有促進(jìn)作用, 是大鼠發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

3 討論

雙膦酸鹽類藥物被認(rèn)為是治療骨科相關(guān)疾病的一線藥物。雙膦酸鹽最早用于紡織業(yè)和石油工業(yè), 在20 世紀(jì)60 年代, 國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了其藥理活性。骨的主要礦物組分為羥基磷灰石［Ca10(PO4)6(OH)2, HA］, 雙膦酸鹽能夠通過與羥基磷灰石結(jié)合抑制其溶解來防止鈣化, 因此認(rèn)為該類藥物能夠?qū)趋兰膊“l(fā)揮潛力作用［3-5］。同時(shí), 在醫(yī)療技術(shù)的不斷深入研究下, 相關(guān)治療藥物得到研發(fā)與應(yīng)用, 且親和力高, 毒副作用小, 能夠針對Paget 病、骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的高鈣血癥進(jìn)行有效治療, 取得了不錯(cuò)效果, 其中一類患者則為骨質(zhì)疏松癥婦女。

與常規(guī)治療比較, 雙膦酸鹽治療可更大程度降低骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)水平, 有利于骨代謝功能改善。唑來膦酸是一種雙膦酸鹽, 具有非常高的藥理活性。對于破骨細(xì)胞而言, 能夠選擇性地對唑來膦酸加以吸收, 并且能夠抑制其的活性, 這使得細(xì)胞凋亡作用變得更明顯, 而破骨細(xì)胞也會(huì)變的更少, 抑制骨吸收。除此以外, 唑來膦酸也能夠與羥基磷灰石結(jié)晶相融合, 影響骨骼表明吸附能力, 生物活性降低, 骨吸收量減少。

唑來膦酸和其他雙膦酸鹽能夠通過抑制破骨細(xì)胞活性來抑制骨質(zhì)流失。一些證據(jù)描述了輔助性T 細(xì)胞17(Th17)與M1 巨噬細(xì)胞之間的緊密相互作用, 但是這些相互作用是否參與唑來膦酸鹽介導(dǎo)的IL-17 增加尚不清楚。最近的研究表明, 細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)可以抑制促炎性M1 巨噬細(xì)胞表型, 而SOCS3 缺乏則通過增加促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-23(IL-23), 從而為Th1 和Th17 細(xì)胞的分化提供了微環(huán)境［6,7］。有趣的是, 唑來膦酸已被證明可以誘導(dǎo)M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)趨向M1 型, 并通過抑制巨噬細(xì)胞中SOCS3 的表達(dá)來增強(qiáng)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)可以解釋唑來膦酸至少部分通過促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化和激活來驅(qū)動(dòng)Th17 分化的機(jī)制。然而, 值得注意的是, 微生物菌群及其生物膜是頜骨壞死(ONJ)的共同特征, 也可能影響巨噬細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的分化和功能。需要通過進(jìn)一步的研究來描述唑來膦酸和口腔微生物菌群如何能夠共同或獨(dú)立地調(diào)節(jié)ONJ 中Th17、M1/M2 巨噬細(xì)胞和其他類型免疫細(xì)胞之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

除唑來膦酸外, 最近的臨床試驗(yàn)還報(bào)道了用地諾單抗治療的患者, 該藥物是針對骨質(zhì)疏松癥和某些癌癥患者普遍指定用作抗吸收藥的抗核因子κB(NF-κB)配體的人類受體激活劑的單克隆抗體(RANKL)。越來越多的證據(jù)表明, 在腫瘤微環(huán)境中激活M1 巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)炎癥反應(yīng), 將其作為癌細(xì)胞免疫監(jiān)視的機(jī)制［8-10］。具有M2 巨噬細(xì)胞特征的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)可以抑制免疫反應(yīng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移, 從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展或減輕炎癥, 并促進(jìn)傷口愈合。最近, 體外和體內(nèi)研究均表明, TAM 可能是雙膦酸鹽類藥物的潛在靶標(biāo), 可能是通過操縱腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞表型來實(shí)現(xiàn)的, 并且通過類似機(jī)制, 炎癥持續(xù)時(shí)間延長, 導(dǎo)致炎癥加劇。對于接受大劑量靜脈內(nèi)雙膦酸鹽預(yù)防和治療骨骼相關(guān)并發(fā)癥的癌癥患者,使用其他抗腫瘤藥物［包括糖皮質(zhì)激素(地塞米松)］、化療藥和(或)抗血管生成藥會(huì)帶來額外的風(fēng)險(xiǎn)。因此,應(yīng)進(jìn)一步探討雙膦酸鹽和這些抗腫瘤藥是否對免疫系統(tǒng)有任何協(xié)同作用, 特別是對Th17 細(xì)胞和M1/M2 巨噬細(xì)胞之間的相互作用有影響, 因?yàn)檫@些免疫細(xì)胞可能起“雙刃”劍的作用, 會(huì)在腫瘤微環(huán)境中增強(qiáng)抗腫瘤免疫力和炎癥反應(yīng)。這種機(jī)制無意中導(dǎo)致了炎癥的延長, 從而延遲了愈合或表現(xiàn)為BRONJ 的骨壞死。

綜上所述, 雙膦酸鹽類藥物會(huì)對區(qū)域骨代謝加速過程中巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)造成影響, 臨床應(yīng)用時(shí)需要加以重視。