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    維生素D 對紫外線誘導(dǎo)豚鼠皮膚曬傷的治療作用及緊密連接蛋白Claudins 家族的影響

    2023-12-13 01:09:54滕用華凌倩周秀英林華龍黃崇煥
    中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用 2023年21期
    關(guān)鍵詞:豚鼠紫外線低劑量

    滕用華 凌倩 周秀英 林華龍 黃崇煥

    曬傷是一種典型的由于暴露在紫外線后皮膚局部出現(xiàn)紅斑、水腫甚至大皰的一種急性光毒性皮炎, 包括表皮損傷, 導(dǎo)致激活的免疫細(xì)胞流入受傷的皮膚創(chuàng)面, 形成局部炎癥環(huán)境, 進(jìn)一步加劇炎癥和延緩組織修復(fù)[1,2]。Scott 等[3]和Das 等[4]的研究提示, 維生素D可能具有治療曬傷的作用, 但具體劑量和機(jī)制仍未明確。本文擬通過建立豚鼠皮膚曬傷模型, 進(jìn)一步驗證維生素D 對曬傷的治療作用及初步探索維生素D 對緊密連接蛋白Claudins 家族的調(diào)節(jié)作用, 以期發(fā)現(xiàn)維生素D 治療曬傷的作用機(jī)制?,F(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 普通級白化豚鼠36 只, 雌性, 體質(zhì)量250 g, 健康, 購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司,許可證號:SCXK(卾)2021-0011。

    1.2 儀器 ES-J120 電子分析天平(天津市德安特傳感技術(shù)有限公司);游標(biāo)卡尺(AIRAJ);HH-4 恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司);無菌注射器(江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司);HGSS-Z 型紫外太陽模擬器(北京衡工儀器有限公司)。

    1.3 試藥 維生素D3(98%, MYM BIOLOGICAL TECHNOLOGY COMPANY LIMITED);硫化鈉(AR, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

    1.4 方法

    1.4.1 豚鼠曬傷模型的建立 將36 只豚鼠隨機(jī)分成模型組、空白對照組、維生素D 低劑量組、維生素D中劑量組、維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組,每組6 只。實驗開始前, 將所有雌性白化豚鼠在動物房飼養(yǎng)7 d 以適應(yīng)環(huán)境, 豚鼠體質(zhì)量均值為250 g。實驗前1 d, 進(jìn)行脫毛處理, 首先將被毛剪短, 在豚鼠脊柱兩側(cè)涂抹10%的硫化鈉溶液, 再用剃毛刀剃出面積為5 cm×4 cm 的脫毛區(qū)。除空白對照組以外, 對其余5 組小鼠進(jìn)行處理:輻照前將豚鼠固定四肢, 進(jìn)行麻醉, 置于HGSS-Z 型紫外太陽模擬器下, 只對脫毛處進(jìn)行照射, 儀器預(yù)熱 15 min, 將光源固定在距豚鼠背部約10 cm 處, 照射時間為8 min[5]。紫外線輻照劑量[6]:中波紫外線(UVB)的輻照強(qiáng)度2.22 mW/(cm2·s), 輻照面積(S)為9 cm2, UVB 的輻照劑量為1.14×104mW。

    1.4.2 給藥方法 建模成功后, 維生素D 低劑量組(1500 IU/kg)、維生素D 中劑量組(3000 IU/kg)、維生素D 高劑量組(6000 IU/kg)、維生素D 預(yù)防治療組(6000 IU/kg, 造模前7 d 開始灌胃給藥, 1 次/d)均給予相應(yīng)劑量維生素D 灌胃, 1 次/d, 給藥7 d;模型組和空白對照組給予等量生理鹽水, 在給藥期間用每天拍照的形式來記錄豚鼠創(chuàng)面愈合情況。

    1.5 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

    1.5.1 豚鼠創(chuàng)面愈合率 通過計算硫酸紙小方格來評估豚鼠曬傷愈合情況, 具體做法是在豚鼠第一次給藥前和最后一次給藥后, 把硫酸紙覆蓋在豚鼠曬傷的部位, 用筆沿豚鼠曬傷的邊緣進(jìn)行傷口描繪, 再將描繪圖形描至小方格紙, 最終通過計算豚鼠曬傷小方格的格數(shù)來表示創(chuàng)面面積[7], 最后計算豚鼠創(chuàng)面愈合率。豚鼠創(chuàng)面愈合率=(豚鼠首次給藥前的創(chuàng)面面積-豚鼠末次給藥后的創(chuàng)面面積)/豚鼠首次給藥前的創(chuàng)面面積×100%。

    1.5.2 豚鼠組織學(xué)檢查 在豚鼠最后一次給藥后, 用剪刀將豚鼠曬傷部位的皮膚剪下, 清洗后將皮膚固定在10%的甲醛溶液中, 對曬傷皮膚進(jìn)行石蠟包埋、切片, 再進(jìn)行組織的蘇木精-伊紅染色(HE 染色), 高倍顯微鏡下觀察各組豚鼠皮膚曬傷情況并拍照, 通過圖片來比較各組豚鼠曬傷皮膚的愈合程度。

    1.5.3 Western blot 于給藥結(jié)束后24 h 后取豚鼠背部皮膚組織, 進(jìn)行蛋白提取、總蛋白溶液變性, 電泳,轉(zhuǎn)膜, 封閉, 一抗孵育, 二抗孵育, 發(fā)光檢測等步驟,檢測Claudin-1、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-5、Claudin-7、Claudin-8 的表達(dá), 比較各組豚鼠曬傷皮膚中Claudins 蛋白的表達(dá)量, 并進(jìn)行結(jié)果分析。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t 檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 豚鼠形態(tài)學(xué)結(jié)果 模型組、維生素D 低劑量組、維生素D 中劑量組、維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組豚鼠皮膚在經(jīng)過紫外線的照射后都出現(xiàn)了面積大小比較相近的紅斑。且在照射后第2 天即用藥前,各組曬傷豚鼠的皮膚紅斑處多轉(zhuǎn)為紅腫, 給藥7 d 后,模型組豚鼠曬傷的皮膚表面紅腫逐漸擴(kuò)散、結(jié)水泡,與其他給藥組相比較為嚴(yán)重, 且結(jié)痂和脫痂的速度均較慢;維生素D 低劑量組愈合情況比模型組稍好, 但不明顯;維生素D 中劑量組豚鼠曬傷創(chuàng)面紅腫擴(kuò)散面積較小, 水泡也較少;維生素D 高劑量組紅腫擴(kuò)散得到控制, 有散在的少量水泡;維生素D 預(yù)防治療組與模型組相比愈合情況明顯更好, 且出現(xiàn)結(jié)痂, 結(jié)痂面積縮小。見圖1。

    圖1 六組豚鼠形態(tài)學(xué)結(jié)果

    2.2 各組豚鼠給藥結(jié)束后創(chuàng)面愈合率比較 維生素D中劑量組豚鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組豚鼠創(chuàng)面愈合率顯著高于模型組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。維生素D 低劑量組豚鼠創(chuàng)面愈合率與模型組比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 各組豚鼠給藥結(jié)束后創(chuàng)面愈合率比較( ±s, %)

    表1 各組豚鼠給藥結(jié)束后創(chuàng)面愈合率比較( ±s, %)

    注:與模型組比較, aP<0.05;bP<0.01

    組別只數(shù)創(chuàng)面愈合率模型組620.57±8.12維生素D 低劑量組6 30.36±8.15維生素D 中劑量組6 36.62±9.18a維生素D 高劑量組6 48.06±5.06b維生素D 預(yù)防治療組6 63.76±7.13b

    2.3 組織學(xué)檢查結(jié)果 從HE 染色結(jié)果可見, 空白對照組豚鼠皮組織結(jié)構(gòu)基本正常, 表皮未見明顯增厚;組織內(nèi)未見有紅細(xì)胞充盈;可見大量毛囊, 組織內(nèi)未見有脂肪空泡。模型組豚鼠皮組織結(jié)構(gòu)重度異常, 棘層結(jié)構(gòu)消失;真皮層膠原纖維大量缺失, 組織內(nèi)可見有大量脂肪空泡, 可見大量炎癥細(xì)胞浸潤, 毛囊結(jié)構(gòu)大量減少。維生素D 預(yù)防治療組和維生素D 高劑量組豚鼠皮組織結(jié)構(gòu)輕度異常, 表皮可見輕微變薄, 可見真皮層有少量炎癥, 可見有少量空泡, 毛囊結(jié)構(gòu)可見, 組織修復(fù)較好, 且維生素D 預(yù)防治療組動物表皮的修復(fù)比維生素D 高劑量組更為完好。維生素D 中劑量組和維生素D 低劑量組皮組織結(jié)構(gòu)仍表現(xiàn)為輕、中度異常,表皮可見輕微增厚, 表皮層可見少量血痂覆蓋, 細(xì)胞排列紊亂, 可見真皮層有少量炎癥, 可見有少量空泡, 與模型組對比有好轉(zhuǎn), 但修復(fù)不明顯。見圖2。

    圖2 六組豚鼠組織學(xué)檢查結(jié)果

    2.4 維生素D 對豚鼠皮膚Claudins 家族的影響 模型組與空白對照組相比, 豚鼠皮膚Claudin 表達(dá)顯著減少;維生素D 低劑量組與模型組比較, 豚鼠皮膚Claudin 表達(dá)有所提高, 但不明顯;維生素D 中劑量組、維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組與模型組比較, 豚鼠皮膚Claudin 表達(dá)有顯著提高, 與組織學(xué)結(jié)果相符合。見圖3。

    圖3 維生素D 對豚鼠皮膚Claudin 蛋白的影響

    3 討論

    當(dāng)皮膚被紫外線照射后, 尤其是被波長為290~320 nm 的中波紫外線(ultraviolet B, UVB)照射時, 細(xì)胞內(nèi)氧自由基會增加, 使皮膚出現(xiàn)老化、水腫、DNA損傷等癥狀, 結(jié)果為直接或間接的誘發(fā)皮膚曬傷的發(fā)生[8,9]。據(jù)統(tǒng)計, 在美國, 關(guān)于導(dǎo)致急診科(ED)的曬傷負(fù)擔(dān)知之甚少。平均而言, 日光灼傷急診的護(hù)理費用為1132.25 美元(±28.69 美元)。因曬傷而就診的流行率和費用在夏季增加[10]。因此, 為了更好的模擬自然曬傷, 作者在該研究中采用的是290~320 nm 的中波紫外線模擬曬傷模型。

    在前期查閱文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn), 建立曬傷模型時如何選取實驗動物較關(guān)鍵, 大鼠品系的選擇對實驗也有影響,通過對比發(fā)現(xiàn)豚鼠的皮膚對紫外線照射比較敏感, 與豚鼠相比較, 大鼠的皮膚較厚, 當(dāng)對大鼠予以同等輻照劑量時, 曬傷卻不明顯, 這就意味著選豚鼠有可能更容易建模成功, 且體質(zhì)量在250 g 以下的豚鼠單側(cè)體表面積不足, 照射面積不夠, 同理小鼠體表面積太小, 無法滿足曬傷需要的傷口大?。?]。因此, 該研究中選用體質(zhì)量為250 g 的豚鼠進(jìn)行模擬實驗。

    Scott 等[3]在一項研究中發(fā)現(xiàn)高劑量口服維生素D3后, 機(jī)體能夠通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá), 減弱局部皮膚對紫外線的炎癥反應(yīng), 抑制紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷, 從而使皮膚紅斑減輕, 皮膚表皮結(jié)構(gòu)的損傷減少。從本研究中的皮膚創(chuàng)面愈合率和形態(tài)學(xué)研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 維生素D低劑量組(1500 IU/kg)對曬傷有一定的治療作用,但效果不明顯, 隨著劑量的增加治療效果顯著增強(qiáng), 而維生素D 預(yù)防治療組(6000 IU/kg)與維生素D 高劑量組(6000 IU/kg)對比, 治療效果更優(yōu), 也驗證了維生素D 對皮膚具有潛在的治療作用, 且治療效果和維生素D 的劑量、給藥時間呈正相關(guān)。

    通常廣義上的皮膚屏障包括色素屏障、物理屏障及免疫屏障等諸多方面, 其中物理屏障結(jié)構(gòu)由緊密連接(tight junction, TJ)和角質(zhì)層(stratum corneum, SC)構(gòu)成, TJ 和SC 共同阻止了外部抗原由內(nèi)部成分由內(nèi)而外的泄漏或者由外向內(nèi)的滲透[11]。TJ 是由許多緊密連接蛋白組成的連接著復(fù)合物介導(dǎo)的、圍繞上皮或者內(nèi)皮細(xì)胞的側(cè)膜、密封著細(xì)胞間隙的最外端的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的吻合鏈帶。TJ 又包括胞漿蛋白和跨膜蛋白。胞漿蛋白又包括ZO 家族和Cingulin 等, 可以連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白F-actin, 胞漿蛋白在細(xì)胞頂端與基底外側(cè)的區(qū)域限制溶質(zhì)的自由通過;跨膜蛋白則包括Claudins 家族、黏連蛋白JAM 家族等, 跨膜蛋白的細(xì)胞外環(huán)部分之間可以互相融合, 可封閉細(xì)胞間隙[12]。當(dāng)前已知Claudins 家族參與了銀屑病、特應(yīng)性皮炎、玫瑰痤瘡、接觸性皮炎等多種皮膚疾病發(fā)病機(jī)制, 通過上調(diào)Claudins 的表達(dá)有利于緩解皮膚疾病[13]。本研究中, 通過Western blot 檢測豚鼠皮膚組織中Claudins家族的表達(dá), 從蛋白印跡實驗中可見, 隨著維生素D給藥劑量和給藥時間的增加, Claudins 的表達(dá)有上調(diào)趨勢, 且以Claudin-5、Claudin-7、Claudin-8 共3 種蛋白的表達(dá)更為明顯, 說明維生素D 治療皮膚曬傷的作用可能與Claudins 家族的表達(dá)有關(guān), 具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步探討。

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