適配體磁納米探針-激光誘導(dǎo)熒光特異識(shí)別微囊藻毒素-LR

齊國(guó)敏, 童詩(shī)謙, 林旭聰, 2*

1. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350108 2. 福州大學(xué)食品安全與環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)研究所, 福建 福州 350108

引 言

微囊藻毒素-LR(MC-LR)具有強(qiáng)烈的肝毒性、 致癌性和發(fā)育毒性[1-2], 亟需嚴(yán)格監(jiān)測(cè)。 水中MC-LR含量低, 且共存物質(zhì)復(fù)雜, 通常采用色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)[3-5], 儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、 使用條件嚴(yán)格, 難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。 熒光光譜分析快速、 儀器簡(jiǎn)便, 研發(fā)高效的熒光分析技術(shù), 對(duì)實(shí)現(xiàn)MC-LR現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)確識(shí)別具有重要意義。

目前, 基于抗原和抗體之間高特異性識(shí)別, 酶聯(lián)免疫、 免疫傳感熒光分析MC-LR得到了研究[6-7]。 然而, 動(dòng)物抗體普遍嚴(yán)重依賴小鼠等動(dòng)物, 小分子抗體制備難度大、 周期長(zhǎng), 且環(huán)境耐受性較弱, 限制了其推廣應(yīng)用。 適配體(Aptamer)作為可替代生物抗體的一種新興生物材料, 親和力高、 條件耐受性好[8-10], 在環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)中得到了廣泛的重視。 Wu等在納米金上修飾適配體-cDNA雜交熒光探針, 基于適體結(jié)合MC-LR并釋放熒光標(biāo)記cDNA, 結(jié)合高速離心(10 000 r·min-1, 1 h)分離, 實(shí)現(xiàn)了MC-LR的熒光分析[11]。 楊新杰等基于DNA上銀納米簇原位生成, 制備了環(huán)狀DNA-銀納米簇, 構(gòu)建了一種無(wú)酶免標(biāo)記檢測(cè)MC-LR的熒光分析方法[12]。 為了簡(jiǎn)化操作, Tang等引入了磁納米顆粒分離技術(shù), 在磁納米粒子表面包覆多巴胺/銅納米簇(PDA/CuNPs), 提出了一種簡(jiǎn)便的適配體磁納米傳感技術(shù), 實(shí)現(xiàn)了MC-LR的光譜檢測(cè)[13]。 然而, 磁納米粒子比表面積較小、 結(jié)合位點(diǎn)普遍較少, 對(duì)適配體負(fù)載容量有限, 導(dǎo)致對(duì)于痕量MC-LR作用后釋放出的熒光探針濃度極低, 識(shí)別靈敏度受到了限制(μg·L-1或亞μg·L-1水平)。 為此, 創(chuàng)新開發(fā)高負(fù)載能力的適配體磁納米傳感界面, 發(fā)展高靈敏的MC-LR分析技術(shù)備受關(guān)注。

近來(lái), 金屬有機(jī)框架(MOF)納米材料因其表面積高、 結(jié)構(gòu)可調(diào)的性質(zhì)得到了重視[14], 引入MOF修飾磁納米粒子, 成為了探針負(fù)載和表面修飾的理想選擇[15-17]。 激光誘導(dǎo)熒光(LIF)基于高能激光束瞬間激發(fā)分子產(chǎn)生熒光, 光譜信號(hào)強(qiáng)度比常規(guī)熒光高出2～4個(gè)數(shù)量級(jí), 靈敏度極高。 迄今, 綜合利用MOF功能化磁納米粒子、 適配體和LIF三者優(yōu)勢(shì), 開發(fā)基于MOF介導(dǎo)高效負(fù)載適配體的磁納米探針及其LIF高靈敏檢測(cè)MC-LR仍未見報(bào)道。 本工作通過金屬有機(jī)框架MIL-101-NH2修飾Fe3O4磁珠, 大幅提升磁粒子比表面積, 高效負(fù)載納米金和適配體-cDNA雜交探針, 形成Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer磁納米熒光探針, 聯(lián)用LIF檢測(cè)技術(shù), 建立痕量MC-LR的超高靈敏分析體系。 實(shí)驗(yàn)詳細(xì)考察了適配體磁納米熒光探針與MC-LR分析可行性、 熒光分析條件、 特異性和穩(wěn)定性, 開展了對(duì)環(huán)境水中MC-LR的分析檢測(cè), 為環(huán)境水體中痕量MC-LR快速、 特異、 高靈敏的熒光分析提供新的技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 適配體分子雜交熒光探針

參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行適配體及其互補(bǔ)鏈雜交孵育, 適配體序列為5’-ATACCACCTCATTATG CCCCATCTCCGC-3’, 熒光互補(bǔ)鏈cDNA序列為5’-FAM-ATGAGGTGTTTT-3, 將適配體及其熒光互補(bǔ)鏈等摩爾量混合, 并按比例V核酸適配體∶V互補(bǔ)鏈∶V緩沖液=1∶1∶8加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS, 10 mmol·L-1磷酸鹽, pH=7.5, 500 mmol·L-1NaCl), 在55 ℃孵育2 h, 制得熒光探針。

1.2 Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer磁納米熒光探針的制備

稱取100 mg羧基化Fe3O4分散于25 mL超純水中, 超聲0.5 h混勻; 加入0.8 g Cr(NO3)3·9H2O, 攪拌5 min, 取2-氨基對(duì)苯二甲酸溶于NaOH溶液(4 mmol·L-1)中, 2-氨基對(duì)苯二甲酸濃度為2 mmol·L-1; 將該溶液緩慢滴入Fe3O4溶液中, 置于100 mL反應(yīng)釜中150 ℃加熱反應(yīng)12 h, 得到綠色的Fe3O4@MIL-101-NH2, 所得產(chǎn)物甲醇浸泡72 h, 用水和乙醇交替清洗3次并在無(wú)水乙醇中保存。

稱取Fe3O4@MIL-101-NH2粉末0.17 mg分散于1mL水中; 取100 μL溶液通過磁分離, 去除上清液, 加入過量的AuNPs溶液反應(yīng)過夜, 得到Fe3O4@MIL-101-NH2@Au; 去除上清液, 取30 μL適配體-cDNA分子雜交熒光探針 (10 μmol·L-1)加入其中, 震蕩15 min, 基于金-硫鍵的作用得到Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer探針; 在此基礎(chǔ)上, 取100 μL 2 mol·L-1的巰基己醇溶液加入上述探針反應(yīng)體系, 振蕩1 h, 進(jìn)行磁納米顆粒的巰基己醇封閉, 制備Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer磁納米熒光探針。

1.3 樣品分析

采集閩江、 西湖和內(nèi)河水樣, 用0.45 μm尼龍水系膜過濾, 加入緩沖液調(diào)節(jié)溶液, 最終組成為10 mmol·L-1PBS, pH 7.5, 500 mmol·L-1NaCl。 稱取0.17 mg適配體磁納米探針加入0.5 mL離心管中, 加入40 μL待測(cè)樣品, 在室溫下振蕩15 min, 磁分離后取上清液, 在激發(fā)波長(zhǎng)497 nm、 發(fā)射波長(zhǎng)512 nm條件下, 室溫下采用LIF進(jìn)行分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 適配體磁納米探針熒光分析可行性

基于MOF-101-NH2對(duì)Fe3O4磁性納米顆粒進(jìn)行修飾, 提升Fe3O4的BET比表面積, 提高AuNPs的負(fù)載和適配體的修飾。 如圖1(a)所示, 測(cè)得Fe3O4和修飾MIL-101-NH2后Fe3O4@MIL-101-NH2的比表面積BET分別為19.86和114.02 m2·g-1, 在Fe3O4表面修飾MIL-101-NH2, 磁納米顆粒實(shí)現(xiàn)了比表面積的大幅提升, Fe3O4@MOF擁有更多的活性位點(diǎn)和吸附容量。

圖1 氮?dú)馕?脫附等溫線圖(a)和適配體磁納米探針-LIF識(shí)別MC-LR的光譜圖(b)Fig.1 N2 adsorption-desorption isotherm of nanoparticles (a) and spectra of aptamer-functionalized magnetic nanoprobe coupled with LIF for the recognition of MC-LR (b)

在此基礎(chǔ)上, 通過鍵合納米金和巰基核酸適配體, 所制備的適配體磁納米探針對(duì)于不同濃度 (0.020～3.000 μg·L-1) 的MC-LR具有特異識(shí)別和靈敏的熒光響應(yīng)。 隨著反應(yīng)溶液中MC-LR濃度的增加, 適配體磁納米探針與目標(biāo)物的結(jié)合而釋放的熒光互補(bǔ)鏈逐漸增加, 體系熒光強(qiáng)度響應(yīng)增加[如圖1(b)所示], 采用適配體磁納米探針-LIF分析檢測(cè)MC-LR具有可行性。

2.2 MC-LR熒光分析的條件優(yōu)化

2.2.1 磁納米顆粒用量的影響

實(shí)驗(yàn)將Fe3O4@MIL-101-NH2@Au磁納米顆粒(簡(jiǎn)稱磁珠)加入適配體分子雜交熒光探針溶液(40 μL, 10 μmol·L-1)中, 通過Au-S鍵固定分子雜交熒光探針后分離制得適配體磁納米探針, 用于MC-LR測(cè)定。 如圖2, 隨著磁珠用量的增加, 磁珠結(jié)合的適配體分子雜交熒光探針增多, 形成Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer探針的量增多, 與MC-LR目標(biāo)物反應(yīng)后體系熒光響應(yīng)值增強(qiáng); 當(dāng)磁珠用量為0.17 mg時(shí), 適配體分子雜交熒光探針在磁珠表面的修飾量和熒光響應(yīng)值達(dá)到最大; 繼續(xù)增大磁珠用量, 磁珠過量, 導(dǎo)致磁珠表面所修飾的探針表面密度下降, 熒光響應(yīng)值降低。

圖2 磁珠用量對(duì)于熒光信號(hào)的影響Fig.2 Effect of the amount of magnetic sphere on fluorescence signal

2.2.2 納米金尺寸的影響

如圖3, 隨著納米金粒徑的增加(17～21 nm), 適配體-cDNA分子雜交熒光探針在Fe3O4@MIL-101-NH2@Au磁納米顆粒上的修飾率逐漸增大并達(dá)到最高98%; 當(dāng)納米金粒徑進(jìn)一步增大時(shí), 納米金比表面積降低, 適配體分子雜交熒光探針修飾率逐漸下降。 當(dāng)納米金粒徑為21 nm時(shí), 所制備的Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer對(duì)MC-LR具有最優(yōu)的熒光響應(yīng)。

圖3 納米金尺寸對(duì)于核酸適配體修飾率和熒光信號(hào)的影響Fig.3 Effect of the size of gold nanoparticle on modification rate of aptamer and fluorescence response

2.2.3 修飾時(shí)間和識(shí)別反應(yīng)時(shí)間的影響

圖4表明, 當(dāng)適配體分子雜交探針在Fe3O4@MIL-101-NH2@Au上修飾反應(yīng)的時(shí)間為5 min時(shí), 適配體分子雜交探針修飾率為86.0%; 隨著巰基適配體分子雜交探針與Fe3O4@MIL-101-NH2@Au作用時(shí)間增加到15 min及以上時(shí), 適配體分子雜交探針修飾率增加到98.8%以上, 探針結(jié)合效率高。

圖4 吸附時(shí)間對(duì)適配體修飾率和反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光響應(yīng)的影響Fig.4 Effects of adsorption time on modification rate of aptamer and reaction time on fluorescence response

同時(shí), 探究了適配體磁納米探針與MC-LR反應(yīng)的時(shí)間。 當(dāng)適配體分子雜交探針與MC-LR結(jié)合后雙鏈雜交結(jié)構(gòu)解開, 熒光互補(bǔ)鏈被釋放出來(lái)而增強(qiáng)上清液熒光強(qiáng)度。 如圖4, 隨著孵育反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng), 適配體磁納米探針與MC-LR識(shí)別反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度逐漸增加, 在15 min時(shí)熒光響應(yīng)達(dá)到最高; 隨著識(shí)別反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng), 體系中部分游離的熒光互補(bǔ)鏈之間產(chǎn)生非特異性結(jié)合或聚集, 熒光強(qiáng)度降低。 實(shí)驗(yàn)中適配體磁納米探針與MC-LR識(shí)別反應(yīng)的時(shí)間為15 min。

2.2.4 pH和NaCl濃度的影響

在不同pH條件下, 適配體紛子雜交探針對(duì)于MC-LR的熒光響應(yīng)不同。 如圖5(a), 當(dāng)緩沖液pH在6.0～7.5時(shí), 熒光響應(yīng)逐漸升高; 當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí), 熒光響應(yīng)反而降低, 這主要是在pH 7.5～8.5時(shí), 適配體與MC-LR親和作用強(qiáng), 熒光互補(bǔ)鏈易于釋放, 熒光響應(yīng)增加; 在pH 7.5～8.5時(shí), 適配體親和識(shí)別能力減弱, 與MC-LR反應(yīng)后熒光響應(yīng)降低。 圖5(b)考察了鹽濃度對(duì)適配體親和識(shí)別作用的影響, 當(dāng)NaCl濃度從100 mmol·L-1增加至500 mmol·L-1時(shí), 反應(yīng)體系的熒光響應(yīng)值逐漸增加, 主要由于高離子濃度的條件下, 溶液中正電荷離子與適配體磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷中和, 降低了適配體上磷酸骨架的負(fù)電荷靜電斥力, 有利于適配體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和親和識(shí)別; 當(dāng)NaCl濃度為600～1 000 mmol·L-1, 溶液鹽度高, 不利于適配體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 高強(qiáng)度鹽度會(huì)抑制適配體的反應(yīng)活性, 體系熒光響應(yīng)大幅度下降。 實(shí)驗(yàn)選擇了pH 為7.5、 NaCl濃度為500 mmol·L-1條件進(jìn)行研究。

2.3 方法性能分析

2.3.1 特異性

實(shí)驗(yàn)在其他干擾毒素(MC-RR、 MC-YR、 OA)存在下對(duì)MC-LR進(jìn)行特異性識(shí)別分析。 如圖6, 反應(yīng)體系對(duì)MC-LR具有良好的熒光響應(yīng), 對(duì)于其他毒素?zé)晒忭憫?yīng)低; 在干擾物共存情況下, 當(dāng)100倍量的干擾毒素(MC-RR、 MC-YR、 OA, 濃度100 μg·L-1), MC-LR(1.0 μg·L-1)對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比其他毒素高20～100倍; 且混合樣品中(目標(biāo)物和干擾物按1∶100比例混合), MC-LR的熒光響應(yīng)與MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)基本一致, 表明適配體磁納米熒光探針對(duì)于MC-LR識(shí)別特異性高, 方法具有良好的選擇性。

圖6 MC-LR識(shí)別特異性及交叉反應(yīng)性Fig.6 Specific recognition and cross-reactivity of MC-LR

2.3.2 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

為了考察適配體磁納米探針熒光分析的重現(xiàn)性, 分析了日內(nèi)、 日間和批間測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。 如表1所示, 對(duì)于不同濃度的MC-LR樣品, 所建立方法的日內(nèi)RSD為1.7%～5.3%(n=3), 相對(duì)誤差(RE)為-2.0%～0.3%, 日間RSD為3.9%～8.8%(n=3), RE為-3.0%～4.1%, 批間SSD為4.9%～8.7%(n=3), RE為-4.3%～0.4%, MC-LR分析具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

表1 Fe3O4@MIL-101-NH2@Au-aptamer對(duì)MC-LR分析的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性Table 1 Stability and reproducibility for MC-LR detection using Fe3O4@MIL-101-NH2@Au-aptamer

2.4 方法應(yīng)用

在最佳條件下, MC-LR濃度與適配體磁納米探針熒光強(qiáng)度之間有良好的線性關(guān)系, 線性范圍為0.020～3.000 μg·L-1, 線性回歸方程為y=90 458x-2 713.9, 決定系數(shù)R2=0.996, 最低檢測(cè)限LOD(3σ/k)為0.006 μg·L-1。 同時(shí), 考察了不同水樣的基質(zhì)效應(yīng)。 如表2, 對(duì)于加標(biāo)濃度分別為0.050、 0.100和1.000 μg·L-1時(shí), 不同水樣中的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)分別為(96.1%±4.0%)～(98.2%±0.5%)、 (95.3%±5.0%)～(98.6%±2.9%)、 (94.3%±2.3%)～(99.1%±3.5%), 所構(gòu)建的Fe3O4@MIL-101-NH2@Au-aptamer熒光傳感基質(zhì)效應(yīng)良好, 水體基質(zhì)沒有對(duì)測(cè)定產(chǎn)生顯著的影響。

表2 實(shí)際水樣中MC-LR測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of MC-LR in water samples

應(yīng)用于樣品分析, 對(duì)三種水樣(福州閩江、 西湖水和內(nèi)河水樣)進(jìn)行測(cè)定。 如表3, 本方法對(duì)空白以及加標(biāo)樣品都有良好的檢出。 綜合考慮基質(zhì)效應(yīng), 湖水、 河水和閩江水樣中MC-LR的回收率計(jì)算值為(93.9%±2.9%)～(104.2%±7.0%), (90.1%±6.4%)～(98.1%±4.1%)和(96.2%±0.5%)～(102.4%±2.9%), RSD為1.4%～5.6%, 該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度; 與LC-MS確證方法分析結(jié)果比較, 兩者檢測(cè)結(jié)果一致, 基于Fe3O4@MIL-101-NH2@Au-aptamer的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)對(duì)MC-LR分析結(jié)果良好。 與文獻(xiàn)報(bào)道的適配體熒光測(cè)定MC-LR的方法比較(LOD為0.010～0.137 μg·L-1)[18-21], 本工作所建立的方法分析全程時(shí)間較快(30 min)、 檢出限更低, 靈敏度高1.6～22.3倍(表4)。

表3 不同水樣中MC-LR的適配體磁納米熒光探針-LIF檢測(cè)分析Table 3 Analysis of MC-LR in water by Fe3O4@MIL-101-NH2@Au-aptemer fluorescence probe

表4 MC-LR特異識(shí)別的適配體熒光分析方法性能比較Table 4 Performance comparison of MC-LR analysis based on fluorescent aptasensor

3 結(jié) 論

針對(duì)磁性顆粒比表面積不高, 納米金在磁納米粒子上修飾密度不高而導(dǎo)致適配體修飾密度低等問題, 本文構(gòu)建了MOF功能化磁性納米顆粒Fe3O4@MIL-101-NH2, 負(fù)載AuNPs并吸附適配體熒光探針, 制備了適配體熒光探針高度負(fù)載修飾Fe3O4@MIL-101-NH2@Au@aptamer新型納米探針, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)MC-LR的激光誘導(dǎo)熒光超靈敏分析。 研究表明, 適配體在磁珠上修飾率高達(dá)98.8%, 對(duì)MC-LR具有高特異選擇性和良好的重現(xiàn)性。 所建立的Fe3O4@ MIL-101-NH2@Au-aptamer熒光傳感探針在30 min內(nèi)可完成對(duì)水體中痕量MC-LR的分析, 檢出限為0.006 μg·L-1, 優(yōu)于大部分文獻(xiàn)中所報(bào)道的熒光分析法檢出限; 應(yīng)用于環(huán)境水樣中MC-LR的檢測(cè), MC-LR回收率為(90.1%±6.4%)～(104.2%±7.0%) (n=3), 與LC-MS的回收率(91.3%±7.0%)～(104.4%±2.0%)(n=3)結(jié)果一致, 實(shí)現(xiàn)了水中痕量MC-LR的準(zhǔn)確識(shí)別和超靈敏檢出, 為環(huán)境水體中MC-LR藻毒素快速靈敏監(jiān)測(cè)提供了新的技術(shù)。