用于快速檢測(cè)鉛離子的新型雙發(fā)射碳點(diǎn)比率熒光探針

易敏娜, 曹匯敏*, 黎雙娜絲, 張朱珊瑩, 朱春楠

1. 中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 湖北 武漢 430074 2. 中南民族大學(xué)認(rèn)知科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430074 3. 中南民族大學(xué)醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430074

引 言

鉛是環(huán)境和生物系統(tǒng)中廣泛分布的最常見、 最有害、 最具毒性的重金屬之一, 可能存在于含鉛質(zhì)的粉類化妝品、 錫器劣質(zhì)陶器的釉質(zhì)或琺瑯、 涂料油漆中。 重金屬鉛在生物體內(nèi)難以被降解, Pb2+通常吸附在顆粒物上, 被舔食或吸入后會(huì)在人體器官中長(zhǎng)期積累造成慢性中毒, 進(jìn)而導(dǎo)致人體神經(jīng)、 免疫、 心血管等多種系統(tǒng)功能被損壞。 世界衛(wèi)生組織和國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將鉛列為致癌物[1], 血鉛水平是判定鉛中毒的主要手段, 含量大于等于0.1 mg·L-1即被判定為鉛中毒。 由于Pb2+的生物毒性和累積性對(duì)人體的危害巨大, 因此研究和開發(fā)具有選擇性和敏感性的探針和方案至關(guān)重要[2]。 傳統(tǒng)的鉛離子檢測(cè)方法有電化學(xué)檢測(cè)法[3-5]、 電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]等, 這些方法雖然已被廣泛使用于鉛的檢測(cè), 但制樣難度大, 并且還需要專業(yè)的技術(shù)和精密儀器支持。 在眾多檢測(cè)方法中熒光傳感法[7]的檢測(cè)周期短、 操作步驟簡(jiǎn)單、 靈敏度高[8], 是一種高效的鉛離子檢測(cè)方法。

近年來, 熒光探針憑借其穩(wěn)定性和高靈敏度受到更多關(guān)注, 許多新型熒光材料已被開發(fā), 如有機(jī)染料、 量子點(diǎn)、 金納米團(tuán)簇等都已用于檢測(cè)金屬離子、 農(nóng)藥殘留、 氣體含量、 化學(xué)藥劑、 生物分子等多種領(lǐng)域。 Zhang等合成了用于酸性化合物中Pb2+的納米活性吸附劑[9]; Sahu等合成摻雜硼的藍(lán)綠色碳點(diǎn), 研究了在生理pH下性能穩(wěn)定的納米傳感探針[10]; Wang等合成了用于檢測(cè)水和活細(xì)胞中Pb2+含量的銀納米團(tuán)簇[11]等。 量子點(diǎn)一般具有毒性, 對(duì)環(huán)境危害大, 為了提高量子點(diǎn)的穩(wěn)定性和生物相容性等特性, 制備過程中需要用某些金屬加以修飾, 這導(dǎo)致成本升高、 合成步驟繁瑣等問題。 碳量子點(diǎn)(CQDs) 也稱為碳點(diǎn)或碳納米點(diǎn), 它具有許多傳統(tǒng)的量子點(diǎn)不具備的優(yōu)點(diǎn), 其光致發(fā)光特性在檢測(cè)有害物質(zhì)方面效果顯著, 是一種成本低、 易于合成、 安全無毒的綠色納米材料, 并且具有較高的穩(wěn)定性[12]、 良好的水溶性[13]、 生物相容性[14]等優(yōu)勢(shì)。

目前, 很多熒光探針還局限于單發(fā)射熒光響應(yīng)來進(jìn)行檢測(cè), 這種方法容易在檢測(cè)過程中受到外界因素的干擾從而影響其檢測(cè)的準(zhǔn)確性。 相比于單發(fā)射量子點(diǎn), 同一激發(fā)下具有兩種發(fā)射峰的雙發(fā)射熒光材料, 能夠與自身對(duì)比參照進(jìn)行標(biāo)定, 通過其熒光強(qiáng)度變化的比值來表達(dá)被測(cè)信息, 具有更好的靈敏度和穩(wěn)定性, 能有效避免外界無關(guān)因素的干擾和探針本征的熒光缺陷, 提高檢測(cè)效果、 靈敏度和穩(wěn)定性。 Mehta等結(jié)合苯并噻唑聚氰乙烯基熒光團(tuán)合成了一種比例熒光肽探針[15], 但其檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng), 完成檢測(cè)最快需要6 min; Gao等采用水熱法合成了雙發(fā)射碳量子點(diǎn), 用于噴墨和檢測(cè)Fe3+[16]; 石吉勇等提出基于碳點(diǎn)和銅納米團(tuán)簇的比率型熒光探針, 用于檢測(cè)螃蟹中Hg2+含量[17]; Shu等以二維鎳基金屬有機(jī)骨架納米片為基體制成可視化即時(shí)檢測(cè)生物分子硫醇的雙發(fā)射比率探針[18], 許多研究者們都在對(duì)雙發(fā)射比率熒光探針進(jìn)行各種研究和嘗試, 但就制備成本、 工序難易程度等方面還存在許多可以優(yōu)化的地方, 從檢測(cè)耗時(shí)方面來看, 許多比率探針目前還無法做到對(duì)被測(cè)物質(zhì)的快速響應(yīng)。

基于上述考慮, 本研究分別以檸檬酸鈉和對(duì)苯二胺(p-PD)為碳源, 采用水相法合成藍(lán)紅兩種碳點(diǎn), BCDs作為響應(yīng)信號(hào)與Pb2+反應(yīng)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱, RCDs對(duì)Pb2+的化學(xué)惰性在整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中用于背景參考, 將兩種碳點(diǎn)按照一定熒光強(qiáng)度比混合, 二者因其物理、 化學(xué)性質(zhì)的改變從而引起光譜的顯著變化[19]。 當(dāng)Pb2+存在時(shí)探針在短短幾秒作出響應(yīng), 視覺上表現(xiàn)出由藍(lán)到紅的熒光顏色變化, 能夠直觀地反映被測(cè)物濃度的含量。 作為Pb2+的選擇性檢測(cè)探針, 通過透射電子顯微鏡 (TEM) 、 熒光光譜和紫外可見吸收光譜等手段進(jìn)行表征和檢測(cè), 依據(jù)粒子大小、 形貌特征、 吸收強(qiáng)度、 熒光光強(qiáng)、 熒光猝滅等信息對(duì)Pb2+的響應(yīng)機(jī)理、 特異性選擇、 pH環(huán)境的影響和熒光穩(wěn)定性能等各種基本性質(zhì)進(jìn)行了比色研究, 以證明該比率熒光探針的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

二水檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O) 分析純(AR, 99.0%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、 氯化銨(NH4Cl)分析純(AR, 99.5%)購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司、 對(duì)苯二胺(p-PD)購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司、 氫氧化鈉(NaOH)、 鹽酸(HCl), Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg·mL-1)購(gòu)自山東省冶金科學(xué)研究院有限公司, Zn2+、 Fe3+、 K+、 Mn2+、 Na+、 Al3+、 Mg2+、 Hg2+、 Ca2+、 Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg·mL-1) 均購(gòu)自北京有色金屬研究總院, 本實(shí)驗(yàn)中使用的所有試劑均為分析級(jí), 無需進(jìn)一步純化。 在整個(gè)制備過程中使用了純水。

美國(guó)Thermo Fishre公司Thermo Scientific Talos F200X透射電子顯微鏡, 美國(guó)PerkinElmer 公司LS-55熒光分光光度計(jì), 島津UV-3600iPlus紫外可見分光光度計(jì), 上海耀特儀器設(shè)備有限公司DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器, 上海精密科學(xué)儀器有限公司FA2204B電子天平, 梅特勒托利多FE28pH計(jì), 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司TG16-WS醫(yī)用離心機(jī), 武漢品冠儀器設(shè)備有限公司PGUV-10-AS超純水機(jī), 南京先歐儀器制造有限公司XO-5200DT超聲波清洗機(jī)。

1.2 藍(lán)紅碳點(diǎn)的制備

藍(lán)色碳點(diǎn) (BCDs) 制備方法參照李文婷等聚四氟乙烯反應(yīng)釜水熱合成方法[20]加以改進(jìn)。 稱取0.4 g檸檬酸鈉和2.12 g氯化銨于50 mL三頸燒瓶中, 加入20 mL純水進(jìn)行攪拌, 通入氬氣后將溫度逐步加熱至100 ℃, 控制溫度不變持續(xù)回流6 h。 將所得的淡黃色溶液BCDs冷卻至室溫后保存在4 ℃條件下以備后續(xù)使用。

紅色碳點(diǎn) (RCDs) 的制備方法如下。 稱取0.216 g對(duì)苯二胺, 溶于20 mL純水中, 倒入50 mL三頸燒瓶中磁力攪拌, 溫度逐步加熱至100 ℃并回流保持5 h, 待溶液冷卻至室溫后, 將得到的產(chǎn)物在10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min以去除不溶性雜質(zhì), 保留上清液, 用純水分散備用。

1.3 鉛離子熒光檢測(cè)

將制備的BCDs與RCDs以合適的體積比混合, 制成熒光強(qiáng)度比約2.3∶1的雙發(fā)射比率探針溶液。 控制溶液總量不變, 分別取980 μL比率探針溶液與20 μL濃度0～0.5 mg·L-1的Pb2+溶液超聲混合均勻, 確保在1 min內(nèi)掃描溶液熒光發(fā)射光譜, 設(shè)置掃描范圍380～800 nm, 激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm。 通過計(jì)算藍(lán)紅碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度比值來定量分析與Pb2+濃度的關(guān)系, 肉眼觀察并記錄其熒光顏色的變化。

1.4 選擇性實(shí)驗(yàn)

將選取的十種常見的干擾離子Zn2+、 Fe3+、 K+、 Mn2+、 Na+、 Al3+、 Mg2+、 Hg2+、 Ca2+、 Cu2+以Pb2+濃度的兩倍, 即濃度為1 mg·L-1的干擾離子分別加入比率熒光探針溶液中, 記錄其熒光響應(yīng), 以離子的熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)考察該探針對(duì)鉛離子的選擇性。

1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)比率探針溶液在0.25、 0.5、 0.75、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 4、 5和6 h時(shí)間內(nèi)進(jìn)行熒光發(fā)射譜掃描, 記錄其熒光響應(yīng), 同上述方法, 分析孵育時(shí)間對(duì)比率探針熒光強(qiáng)度的影響。

用NaOH和HCl調(diào)節(jié)去離子水的pH值, 配制Pb2+濃度為0.1 mg·L-1的溶液, 將含Pb2+的比率探針溶液分散在等量的pH值為1～14的溶液中, 記錄其熒光強(qiáng)度隨pH值的變化趨勢(shì), 通過熒光強(qiáng)度比考察pH值對(duì)比率探針熒光性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs及比率探針的表征

采用TEM對(duì)CDs的尺寸、 形貌等性質(zhì)進(jìn)行表征。 圖1(a)表明制備的BCDs與RCDs納米粒子分布均勻, 具有良好的單分散性。 BCDs顆粒呈球形, 平均直徑小于10 nm, 在高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM)下呈晶格條紋狀[圖1(a)插圖]。 當(dāng)Pb2+與BCDs-RCDs共存的情況下, 圖1(b) TEM結(jié)果表明, BCDs表面官能團(tuán)與Pb2+之間的螯合和靜電相互作用[21]導(dǎo)致納米粒子聚集形成團(tuán)簇, RCDs保持穩(wěn)定不參與反應(yīng), 這一現(xiàn)象印證了藍(lán)色熒光猝滅的原因, 圖1(b)插圖為HRTEM圖像, 清晰地顯示了BCDs的與Pb2+聚集形態(tài)。

圖1 (a) BCDs和RCDs的TEM圖像, 插圖為BCDs的HRTEM圖像; (b) BCDs-RCDs與Pb2+的TEM圖像, 插圖為BCDs與Pb2+聚集后的HRTEM圖像Fig.1 (a) TEM images of BCDs and RCDs, Inset is the HRTEM image of BCDs; (b) TEM images of BCDs-RCDs and Pb2+, Inset is the HRTEM image after BCDs and Pb2+ aggregated

采用熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜分別對(duì)BCDs、 RCDs和雙發(fā)射比率探針的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。 圖2(a)所示, 發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm時(shí), BCDs的激發(fā)光譜在251和353.5 nm出現(xiàn)兩個(gè)激發(fā)峰; 發(fā)射波長(zhǎng)為700 nm時(shí), RCDs激發(fā)光譜激發(fā)峰在300和360.5 nm附近。 為保證兩者同時(shí)被激發(fā), 選取360 nm作為激發(fā)波長(zhǎng), 圖2(b)黑色曲線所示, 比率探針在440和712 nm出現(xiàn)兩個(gè)發(fā)射峰熒光信號(hào), 且峰寬較窄。 在365 nm手持紫光燈照射下肉眼可見明亮的藍(lán)色熒光和紅色熒光[圖2(b)插圖]。 兩者混合后可能由于BCDs與RCDs發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)[20], 導(dǎo)致BCDs的熒光略有降低。

圖2 (a) BCDs與RCDs歸一化的激發(fā)光譜圖; (b) BCDs、 RCDs及混合溶液的熒光發(fā)射光譜(λex=360 nm)Fig.2 (a) Excitation spectra normalized by BCDs and RCDs; (b) Fluorescence emission spectra of BCDs, RCDs and mixed solutions (λex=360 nm)

2.2 鉛離子的響應(yīng)機(jī)理

整個(gè)鉛離子的傳感檢測(cè)體系中BCDs發(fā)揮主要作用, RCDs不參與反應(yīng), 只有BCDs顆粒表面的官能團(tuán)與Pb2+的螯合作用導(dǎo)致納米粒子相互之間吸附聚集, 從而發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象導(dǎo)致熒光顏色發(fā)生變化, 示意圖如圖3所示。

圖3 比率熒光探針Pb2+檢測(cè)示意圖Fig.3 Schematic diagram of ratio fluorescent probe Pb2+ detection

以目前醫(yī)學(xué)應(yīng)用的Pb2+含量范圍為標(biāo)準(zhǔn)分別考察了0～0.50 mg·L-1Pb2+濃度下單個(gè)碳點(diǎn)與比率探針對(duì)鉛離子的響應(yīng)。 圖4中Pb2+在342 nm處存在吸收峰, 與BCDs的峰值所在的位置接近, BCDs的激發(fā)光譜和Pb2+的紫外吸收光譜形狀相似, 表明該碳點(diǎn)能夠用于檢測(cè)Pb2+。

圖4 BCDs的激發(fā)光譜和Pb2+的紫外吸收光譜Fig.4 Excitation spectra of BCDs and UV absorption spectra of Pb2+

RCDs與Pb2+混合時(shí)不發(fā)生反應(yīng), 如圖5(a)所示, 712 nm處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度在0～0.50 mg·L-1濃度的Pb2+存在時(shí)幾乎保持不變, 因此可以證實(shí)RCDs對(duì)Pb2+無響應(yīng)。 BCDs表面的-COOH能夠與Pb2+形成螯合產(chǎn)物, -NH2與Pb2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)使得藍(lán)色熒光顆粒產(chǎn)生聚集現(xiàn)象, 基于內(nèi)濾波效應(yīng)導(dǎo)致熒光猝滅[22], TEM圖1(b)也能證明這一現(xiàn)象。 圖5(b)體現(xiàn)了隨著Pb2+濃度的提高, 440 nm處的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度逐漸減弱, 插圖為365 nm紫光燈照射下的熒光變化情況。

圖5 (a) RCDs的熒光發(fā)射光譜; (b) BCDs的熒光發(fā)射光譜Fig.5 (a) Fluorescence emission spectra of RCDs; (b) Fluorescence emission spectra of BCDs

根據(jù)藍(lán)紅碳點(diǎn)的不同體積配比設(shè)置熒光強(qiáng)度比I440/I712分別為1.3∶1、 1.8∶1和2.3∶1時(shí)測(cè)試不同濃度下對(duì)Pb2+的熒光響應(yīng), 確定兩種碳點(diǎn)的發(fā)射峰比值為2.3∶1時(shí)從藍(lán)色到紫紅色的熒光顏色變化范圍最寬。 將藍(lán)紅碳點(diǎn)基于最佳熒光強(qiáng)度2.3: 1均勻混合成比率熒光探針溶液, 通過熒光強(qiáng)度和顏色的變化來實(shí)現(xiàn)鉛離子含量的判定。 如圖6(a)為0～0.50 mg·L-1濃度的Pb2+比率熒光探針的發(fā)射光譜, 插圖為溶液由藍(lán)色到紅色的變化情況。 比率探針在440 nm處的熒光強(qiáng)度隨Pb2+的濃度增加呈規(guī)律性遞減趨勢(shì), 而712 nm處的熒光強(qiáng)度不受其濃度影響。 為明確比率探針熒光強(qiáng)度與Pb2+濃度的關(guān)系, 繪制440和712 nm處的峰值比值I440/I712與Pb2+濃度的關(guān)系圖來評(píng)估Pb2+含量[21]。 如圖6(b)所示, 二者線性關(guān)系良好,R2=0.987 44, 基于三倍標(biāo)準(zhǔn)差規(guī)則, LOD=3σ/s, 其中σ為空白探針樣品測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差,s為線性擬合曲線的斜率, Pb2+的檢出限為0.013 6 mg·L-1。 以上數(shù)據(jù)均由三組實(shí)驗(yàn)所得。

圖6 (a) 比率熒光探針與Pb2+混合后的發(fā)射光譜; (b) I440/I712比值與Pb2+濃度的線性關(guān)系Fig.6 (a) Emission spectra of ratio fluorescent probe mixed with Pb2+; (b) Linear relationship between I440/I712 ratio and Pb2+ concentration

2.3 比率熒光探針的選擇性

選擇性是對(duì)熒光探針性能評(píng)估的一個(gè)很關(guān)鍵的指標(biāo), 選取了十種生活中常見的金屬陽離子Zn2+、 Fe3+、 K+、 Mn2+、 Na+、 Al3+、 Mg2+、 Hg2+、 Ca2+、 Cu2+作為干擾離子分別加入比率探針溶液中, 除Cu2+外未觀察到干擾離子熒光比值(I440/I712)/(I440/I712)0的明顯變化(圖7) , 其中(I440/I712)0為無任何離子存在時(shí)的熒光強(qiáng)度比。 由于RCDs的碳源p-PD中氮原子的孤對(duì)電子與Cu2+的空軌道能形成絡(luò)合物會(huì)使得712 nm處的熒光強(qiáng)度增大, 但在整個(gè)體系中RCDs含量極少且BCDs對(duì)Cu2+具有惰性, 對(duì)整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的影響微乎其微, 因此在365 nm激發(fā)下仍然表現(xiàn)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。 干擾離子對(duì)藍(lán)色熒光幾乎沒有猝滅作用, 實(shí)驗(yàn)表明比率探針對(duì)Pb2+有良好的選擇性。

圖7 比率熒光探針對(duì)其他金屬離子的選擇性Fig.7 Selectivity of the ratio fluorescent probe to other metal ions

2.4 比率熒光探針的穩(wěn)定性

以孵育時(shí)間和pH環(huán)境為變量, 利用熒光光譜法系統(tǒng)研究了比率熒光探針的穩(wěn)定性。 圖8(a)為室溫下相對(duì)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況, 探針的相對(duì)熒光強(qiáng)度在6 h內(nèi)變化微小, 表明光學(xué)穩(wěn)定性良好。 不同pH環(huán)境下比率探針的熒光變化情況如圖8(b)所示, 在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境下探針的熒光強(qiáng)度有很大的變化, 在pH<3的強(qiáng)酸環(huán)境下, 由于BCDs表面-COOH和-NH2與H+結(jié)合去質(zhì)子化, 削弱了Pb2+的螯合作用, 導(dǎo)致BCDs失去穩(wěn)定性, 使得藍(lán)色熒光減弱[23]。 在pH值為12、 13的堿性條件下, Pb2+與高濃度的OH-結(jié)合形成沉淀從而減弱Pb2+對(duì)BCDs的猝滅反應(yīng)程度, 因此熒光強(qiáng)度驟增。 pH值為14的強(qiáng)堿環(huán)境下, BCDs表面的官能團(tuán)被破壞, 導(dǎo)致熒光減弱[24]。 在pH值為3～11較大的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度比值波動(dòng)不大, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針具有較好的耐鹽性和耐酸性。 綜合上述結(jié)果與討論, 表明該探針的熒光穩(wěn)定性良好。

圖8 (a) 孵育時(shí)間對(duì)比率探針性能的影響; (b)不同pH對(duì)比率探針性能的影響Fig.8 (a) Effect of incubation time on the performance of ratio probes; (b) Effect of different pH on the performance of ratio probe

3 結(jié) 論

采用水相合成法制備了能快速檢測(cè)鉛離子的雙發(fā)射可視化比率熒光探針, TEM圖顯示探針尺寸小、 粒徑均勻, 該探針無需任何修飾, 成本低、 檢測(cè)方法簡(jiǎn)便。 結(jié)果表明BCDs-RCDs具有斯托克斯位移大、 光穩(wěn)定性好、 發(fā)射帶譜窄的優(yōu)點(diǎn)。 基于熒光猝滅的原理, 雙發(fā)射比率熒光探針通過熒光顏色的變化實(shí)現(xiàn)Pb2+的可視化檢測(cè), 兩種熒光團(tuán)之間的熒光強(qiáng)度比與Pb2+濃度具有良好的線性關(guān)系, 檢出限低至0.013 6 mg·L-1。 該比率探針無需長(zhǎng)時(shí)間孵育便能快速對(duì)Pb2+做出反應(yīng), 在較大pH范圍和時(shí)間范圍內(nèi)探針的靈敏度和穩(wěn)定性良好, 檢測(cè)濃度也符合醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需范圍, 在不同生理?xiàng)l件下有較好的生物傳感應(yīng)用潛力, 在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景, 也為臨床醫(yī)學(xué)的即時(shí)檢測(cè)提供了新的思路。