HIF-1α在胰腺導管腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展

高 璠,郭萬慧,韓 超,彭雁飛,周 昆,孫力康*

0 引言

胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)在胰腺惡性腫瘤中最為多見,約占90%左右。PDAC通常在晚期被發(fā)現(xiàn),與偶然發(fā)現(xiàn)的胰腺早期疾病相比,其確診后的存活率很低[1]。美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計,預計2023年,因胰腺癌而死亡的人數(shù)高達50 550人[2]。近年來,多用異型增生來描述細胞增生并出現(xiàn)異型性,其與腫瘤形成相關(guān)且多用于上皮組織來源的病變[3]。原位癌是癌前病變,有惡性腫瘤的特點,但還沒有突破基底膜向下浸潤。目前,臨床上采用上皮內(nèi)瘤變(Intraepithelial neoplasia,IN)概括上皮的異型增生和原位癌。上皮內(nèi)瘤變是癌癥的高風險因素[4]。胰腺上皮內(nèi)瘤變(Pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)是最典型且常見的PDAC癌前病變,是胰腺導管腺癌的高風險因素[5]。隨著對胰腺導管上皮增生性病變研究的深入,PanIN逐漸被臨床、科研等領(lǐng)域接受,根據(jù)Hruban等[6]提出的胰腺上皮內(nèi)瘤變分級系統(tǒng)和病理診斷標準,PanIN按嚴重程度從低到高分為PanIN-1(A,B)、PanIN-2和PanIN-3。其中,PanIN-3病變也稱為原位癌,若進一步惡化,細胞突破基底膜后則稱為胰腺導管腺癌。一旦確診為癌癥,5年生存率不足5%,因此,迫切需要尋找早期診斷指標。

胰腺導管腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著典型的缺氧微環(huán)境,而缺氧誘導因子-1α (Hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)作為缺氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子,參與調(diào)節(jié)PanIN各階段相關(guān)基因,推動PanIN向PDAC進展。此外,在HIF-1α的調(diào)節(jié)下,腫瘤細胞還發(fā)生代謝重編程、血管新生、具有藥物抗性以及遷移能力增強等改變。本文從PDAC腺癌前病變開始,探討在PDAC的發(fā)生發(fā)展過程中,HIF-1α對PanIN及PDAC相關(guān)基因表達的影響。

1 HIF-1α簡介

HIF-1是一種螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子,參與許多重要的缺氧穩(wěn)態(tài)反應,通過控制轉(zhuǎn)錄反應來降低機體對氧氣的利用率[7]。HIF-1是由2種亞基組成的異二聚體蛋白,這2種亞基分別是參與氧氣調(diào)節(jié)的HIF-1α和控制結(jié)構(gòu)性表達的HIF-1β。惡性腫瘤細胞的異常生長和增殖使得實體瘤普遍處于缺氧環(huán)境中,腫瘤細胞適應缺氧微環(huán)境主要依賴于HIF-1α介導的調(diào)節(jié)途徑[8]。HIF-1α是癌癥進展和靶向治療的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在氧氣充足的環(huán)境中,HIF-1α被泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway,UPP)降解失活。相反,在缺氧環(huán)境中,HIF-1α逃脫降解并進入細胞核,然后上調(diào)許多與癌癥進展有關(guān)的基因[9]。過表達的HIF-1α和下游基因通過各種機制促進腫瘤發(fā)生發(fā)展,包括血管生成、細胞增殖和存活、代謝重編程、侵襲和轉(zhuǎn)移、癌癥干細胞維持、遺傳不穩(wěn)定性的誘導和治療抗性。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,HIF-1α 還可以被與缺氧無關(guān)的信號通路激活[10]。

臨床研究顯示,在腫瘤發(fā)生前期HIF-1α出現(xiàn)積累[11-13]。與正常組織相比,腫瘤組織、IN組織中HIF-1α高表達;與低級別IN相比,高級別IN組織中HIF-1α表達水平增高;此外,在腫瘤附近的IN組織中檢測到HIF-1α表達水平比獨立IN組織中更高。結(jié)果表明,HIF-1α在IN發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用,這可能與HIF-1α調(diào)節(jié)IN相關(guān)基因密切相關(guān)[13]。

2 HIF-1α與PanIN相關(guān)基因的相互作用

PanIN的發(fā)生率隨著年齡的增長而增加,與老年人群中胰腺癌發(fā)病率的增加相對應[14]?；趯θ梭w組織樣本的回顧性分析,推測胰腺外分泌細胞中積累了一系列基因組突變,導致胰腺上皮內(nèi)瘤變,然后發(fā)展為侵襲性PDAC[15]。但并不是所有低級別病變都向高級別病變發(fā)展,在發(fā)展過程中,存在部分高級別上皮內(nèi)瘤變向低級別轉(zhuǎn)歸的現(xiàn)象。根據(jù)基因改變出現(xiàn)的時間節(jié)點不同,研究者將其分為早期改變和晚期改變基因。早期改變有原癌基因KRAS突變、粘蛋白MUC5AC過表達、抑癌基因P16失活及粘蛋白MUC1表達變化等;晚期改變有抑癌基因TP53突變等[16-18]。見圖1。HIF-1α對以上基因的調(diào)節(jié)作用見圖2。

圖1 胰腺上皮內(nèi)瘤變的發(fā)展階段及突變基因

2.1 HIF-1α與KRAS之間的正反饋調(diào)節(jié)KRAS(Kirsten rat sarcoma virus)是為制造K-Ras蛋白質(zhì)提供指令的基因,是RAS/MAPK途徑的一部分。KRAS原癌基因的突變是PanIN逐步進展過程中的重要因素[19]。研究表明,隨著PanIN級別升高,KRAS突變頻率增加,人類PDAC中幾乎普遍存在KRAS突變(>95%)[20]。臨床研究顯示,與KRASG12R突變相比,KRASG12D突變的PDAC患者總體生存率降低[21]。研究者采用p48-Cre誘導KRAS突變,獲得從正常胰腺到胰腺導管腺癌發(fā)展各階段的基因工程小鼠模型,在小鼠2月齡時,其胰腺組織結(jié)構(gòu)正常,在小部分區(qū)域出現(xiàn)上皮內(nèi)瘤變。在野生型樣本中,低氧探針(pO2水平≤1% 的指標)和HIF-1α蛋白幾乎檢測不到,而在2個月大的KRASG12D小鼠胰腺組織中觀察到低氧探針陽性細胞和HIF-1α表達顯著增加,表明胰腺上皮內(nèi)瘤變過程也處于低氧環(huán)境,KRASG12D突變促進HIF-1α積累[22]。此外,HIF-1α或缺氧條件可以上調(diào)KRAS活性及其下游信號的激活[23]。因此,在KRAS激活和HIF-1α之間形成了正反饋調(diào)節(jié)。

上述結(jié)果提示,HIF-1α與KRAS2個信號共同作用,促進PanIN向更高級別進展。

2.2 HIF-1α上調(diào)粘蛋白MUC5AC的表達 粘蛋白(Mucoprotein)是高分子糖蛋白,在正常的呼吸道和消化道形成一層屏障,保護下層上皮組織免受炎癥、感染、酸(胃腸道內(nèi))和其他生理損傷[24]。MUC5AC是一種重度糖基化的凝膠形成分泌粘蛋白,在多種惡性腫瘤中具有可靠的預后價值[25]。大量研究表明,MUC5AC在正常胰腺導管內(nèi)不表達,但在PanIN-1A階段表達,且在PDAC和癌前病變中均以高水平表達[26-28]。在缺氧條件下,HIF-1α水平的升高能夠顯著促進MUC5AC蛋白表達。在常氧條件下,使用HIF-1α抑制劑或HIF-1α siRNA下調(diào)HIF-1α的水平后,MUC5AC的分泌與蛋白表達也隨之下調(diào)。表明無論在RNA水平還是蛋白水平上,HIF-1α均能干預MUC5AC[29-30]。而且,缺氧條件下MUC5AC啟動子活性增加,熒光素酶測定表明,MUC5AC啟動子中的缺氧反應元件(Hypoxia-response element,HRE)在-120～+54區(qū)域。啟動子序列分析表明,-65處的HRE位點在MUC5AC的缺氧激活中起重要作用。使用定點誘變使HRE部位失活導致缺氧誘導完全喪失,進一步證實了MUC5AC啟動子中的缺氧反應元件HRE部位在缺氧環(huán)境中的關(guān)鍵作用[30]。結(jié)果顯示,缺氧或可通過上調(diào)HIF-1α表達,進而上調(diào)粘蛋白MUC5AC的表達,促進胰腺上皮內(nèi)瘤變進展。

2.3 腫瘤抑癌基因P16抑制HIF-1α的表達 腫瘤抑癌基因P16亦稱為多腫瘤抑制因子(Multiple tumor suppressor,MTS),是細胞周期中的基本基因,直接參與細胞周期的調(diào)控。腫瘤抑癌基因P16失活發(fā)生在PanIN-1B階段[27]。P16位于9p21,是多種惡性腫瘤雜合性丟失(Loss of heterozygosity,LOH)的位點,因此P16與多種腫瘤有關(guān)[31]。P16與KRAS、TP53、SMAD4(該基因編碼信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad家族的1個成員,Smad蛋白被跨膜絲氨酸-蘇氨酸受體激酶磷酸化和激活,以響應轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β信號)的失活是人類PDAC中最常見的基因突變。這些突變基因是胰腺癌中涉及的“四大”基因[32]。研究者用小干擾RNA干擾P16表達后,AKT/mTOR通路隨之被激活;同時,HIF-1α表達上調(diào),進而上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)。結(jié)果表明,HIF-1α是P16基因的下游靶點,當抑癌基因P16失活后,HIF-1α逐漸積累并調(diào)控下游促腫瘤因子,如VEGFA等,從而促進胰腺上皮內(nèi)瘤變的發(fā)展[33]。

2.4 粘蛋白MUC1上調(diào)HIF-1α的表達 人MUC1粘蛋白是一種膜結(jié)合糖蛋白,是正常腺細胞導管細胞表面的主要成分。MUC1在癌細胞中過度表達并異常糖基化[34]。Maitra等[35]研究表明,MUC1在正常小葉內(nèi)和小葉間胰腺導管中100%表達,在PanIN-2和PanIN-3中的表達分別為43%和85%,但在PanIN-1A和PanIN-1B中只存在5%、6%的表達。因此,在胰腺癌的進展過程中,MUC1從低表達到過表達,其表達由正常極化上皮細胞的頂端變?yōu)閺V泛分布于非極化腫瘤細胞的細胞膜表面。MUC1通過調(diào)節(jié)HIF-1α的表達、穩(wěn)定性和活性,在胰腺癌細胞中作為低氧反應的調(diào)節(jié)劑。Chaika等[36]研究顯示,MUC1在物理上占據(jù)參與糖酵解的多個基因的啟動子并調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝酶活性。在此基礎(chǔ)上,MUC1表達促進胰腺癌細胞的葡萄糖攝取。此外,HIF-1α是吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞(Gem-R細胞)葡萄糖代謝和嘧啶生物合成增強的代謝主調(diào)節(jié)因子,抑制HIF-1α的表達可提高細胞對吉西他濱的敏感性。Shukla等[37]研究顯示,MUC1增強HIF-1α表達水平并降低Gem-R細胞對吉西他濱的敏感性。上述研究表明,MUC1不僅可以上調(diào)HIF-1α來促進胰腺腫瘤細胞代謝重編程能力,以適應胰腺癌的缺氧環(huán)境;還可以通過上調(diào)HIF-1α增強胰腺癌細胞的耐藥性。在MUC1過表達進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中,HIF-1α起重要的紐帶作用。

2.5 抑癌基因 TP53下調(diào)HIF-1α的表達 TP53抑癌基因位于染色體臂17p上,是人類實體腫瘤中最常失活的抑癌基因,在55%～75%的侵襲性胰腺癌中失去抑癌活性[38]。TP53突變的發(fā)生率隨著癌前病變程度的增加而增加,在低級別PanIN中發(fā)生率非常低,但在高級別PanIN中發(fā)生率顯著升高[39]。TP53腫瘤抑制因子可以被各種細胞應激反應激活,包括癌基因表達、DNA損傷、缺氧、代謝功能障礙等,然后以適當?shù)姆磻獊硪种瓢┌Y的發(fā)生[40]。在常氧環(huán)境中,HIF-1α在脯氨酸殘基處被如von Hippel-Lindau 抑癌基因蛋白(VHL)和 MDM2 (Mouse Double Minute 2 homolog)等蛋白泛素化,最終HIF-1α被蛋白酶體降解[41]。突變后的TP53 (Mutant p53,mutp53)可以在缺氧條件下破壞HIF-1α與泛素蛋白連接酶MDM2的結(jié)合。研究顯示,癌細胞中HIF-1α及其靶基因的高表達可能是mutp53解離HIF1α-MDM2的直接后果[42]。上述結(jié)果表明,HIF-1α作為P53的靶基因,參與調(diào)控胰腺腺泡細胞導管樣化生及PanIN進程,促進PanIN-3向PDAC惡性轉(zhuǎn)化。

3 HIF-1α與PDAC相關(guān)基因的相互作用

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,其特征是高度缺氧的腫瘤微環(huán)境。HIF-1α是細胞對氧濃度變化反應的主要調(diào)節(jié)因子,幫助腫瘤細胞在缺氧腫瘤微環(huán)境中適應缺氧。HIF-1α在胰腺癌的癌變和進展中起核心作用,其與PDAC相關(guān)基因的相互作用見表1。

表1 HIF-1α與PDAC相關(guān)基因的相互作用

3.1 HIF-1α與賴氨酸特異性去甲基化酶(Lysine-specific demethylase 1,LSD1)之間的正反饋調(diào)節(jié) LSD1也稱為KDM1A、BHC110、AOF2,是首個被發(fā)現(xiàn)的人類組蛋白去甲基化酶[43],在許多癌癥中均高表達,包括胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、神經(jīng)母細胞瘤和急性髓系白血病[44]。在胰腺癌細胞中,LSD1具有癌基因功能,參與調(diào)控促進細胞增殖相關(guān)基因,從而促進體外細胞遷移和侵襲[45-46]。對48例人體胰腺癌組織樣本進行免疫組織化學染色分析的研究顯示,與正常組織相比,胰腺癌組織中,LSD1表達增加,且其表達增加與胰腺癌患者的不良預后相關(guān)。此外,LSD1敲低的胰腺細胞葡萄糖攝取和乳酸生成也顯著降低。HIF-1α穩(wěn)定表達會上調(diào)LSD1的mRNA和蛋白水平,LSD1表達降低也會導致 HIF-1α靶向限速糖酵解酶在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)?？傊?在缺氧條件下,LSD1和HIF-1α相互調(diào)節(jié)并形成正反饋回路,以增強細胞糖酵解能力,從而促進胰腺癌細胞不受控制的增殖。

3.2 HIF-1α上調(diào)血VEGF VEGF蛋白家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(Placental growth factor,PlGF),其中,鑒于VEGF-A在調(diào)節(jié)血管生成及疾病中起主導作用,研究者通常將其稱為VEGF[47]。與正常胰腺和慢性胰腺炎相比,VEGF在胰腺癌中過度表達,在93%的胰腺導管腺癌中VEGF 蛋白呈陽性。VEGF在胰腺癌組織中的陽性表達率為77%,在鄰近的正常胰腺組織中只有 15%[48-49]。VEGF是HIF-1α的下游靶標,缺氧狀態(tài)下,VEGF的表達主要受HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)[50]。HIF-1α上調(diào)后,VEGF分泌升高對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起至關(guān)重要的促進作用。HIF-1α表達與VEGF表達呈正相關(guān)。在胰腺癌細胞中,采用轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低BXPC-3細胞中HIF-1α后,VEGF表達顯著下調(diào)[51],影響腫瘤微環(huán)境,進一步抑制腫瘤血管新生,從而降低胰腺癌細胞的侵襲、遷移能力。

3.3 HIF-1α上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留因子1 (Retention in endoplasmic reticulum-1,RER1) RER1是多種蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要保留因子,其與許多蛋白質(zhì)相互作用,并將它們招募到COPⅠ囊泡,從而轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[52]。RER1不僅與胰腺腫瘤細胞干性相關(guān),還促進胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移。與正常胰腺導管上皮細胞hTERT-HPNE相比,胰腺癌細胞中RER1的表達更高。研究顯示,與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者相比,RER1的表達顯著增高,RER1高表達可能與胰腺癌患者預后不良有關(guān),RER1 表達較高的患者的復發(fā)率更高,生存率更低[53]。缺氧環(huán)境下,HIF-1α無法通過泛素化降解,從而在體內(nèi)堆積,隨后RER1的表達也被上調(diào)。研究顯示,腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因也受RER1調(diào)節(jié),與其呈正相關(guān)[53]?？傊?缺氧誘導HIF-1α表達促進RER1表達,從而調(diào)節(jié)胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因,促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[54]。

3.4 HIF-1α下調(diào)白細胞介素IL-37 IL-37已被確定為先天免疫和適應性免疫的抑制劑[55]。研究表明,IL-37可以依賴于 caspase-1 的方式易位到細胞核中,從而減少細胞因子的產(chǎn)生并影響先天性和適應性免疫反應[56]。在炎癥環(huán)境中,IL-37通過下調(diào)焦亡相關(guān)蛋白,抑制急性胰腺炎小鼠腺泡細胞死亡[57]。在胰腺癌患者樣本中,與鄰近的正常胰腺組織相比,PDAC組織中的IL-37表達顯著降低。PDAC中IL-37表達降低與PDAC組織學分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管浸潤增加相關(guān)。低表達IL-37患者的無復發(fā)生存期和總生存期顯著縮短[58]。此外,在胰腺癌細胞耐藥性的研究中,IL-37 表達與吉西他濱療效呈正相關(guān),而在吉西他濱耐藥性強的細胞系中,HIF-1α表達上調(diào),研究人員通過IHC染色探究人 PDAC 樣本中HIF-1α和IL-37的表達情況,結(jié)果顯示,在 PDAC 的連續(xù)切片中,HIF-1α和IL-37表達呈負相關(guān)[58],表明HIF-1α可能通過與IL-37啟動子中的缺氧反應元件結(jié)合來減弱IL-37轉(zhuǎn)錄,降低IL-37表達水平,從而促進PDAC對吉西他濱的耐藥性及遷移能力。

4 小結(jié)

HIF-1α調(diào)控多種血管新生的基因,在生理狀態(tài)下發(fā)揮促進血管生成的作用,HIF-1α激動劑在缺血性疾病方面有積極的治療作用[59]。但在腫瘤中,HIF-1α作為缺氧環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,對PDAC的影響貫穿了整個發(fā)生發(fā)展過程。通過不同的方式抑制HIF-1α的活性,對于惡性腫瘤的治療具有重要意義[60]。對PDAC癌前病變相關(guān)基因差異表達的研究顯示,從正常組織到胰腺上皮內(nèi)瘤變組織再到胰腺導管腺癌組織中,HIF-1α的表達水平越來越高[11]。此外,在胰腺上皮內(nèi)瘤變的發(fā)展過程中,不斷有腫瘤調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生差異表達,其中具有代表性的有早期改變基因:原癌基因KRAS、粘蛋白MUC5AC、抑癌基因P16及粘蛋白MUC1等;晚期改變基因:抑癌基因TP53。這些發(fā)生改變的基因與HIF-1α互相作用,提示HIF-1α可能通過調(diào)控PanIN各階段相關(guān)基因,進而調(diào)控PanIN進程。此外,HIF-1α還從多個角度參與促進PDAC的發(fā)展,其中包括幫助腫瘤細胞代謝重編程、血管生成、促進胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及增強腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性等。

胰腺位置隱匿,檢測手段有限,缺乏有效的早期診斷,使PDAC總體5年生存率極低。目前,首選的治療方案仍是手術(shù)切除或以吉西他濱為代表的藥物進行化療,但效果仍然有限,迫切需要開發(fā)早期診斷和治療工具[61]。與胰腺導管腺癌相似,宮頸癌也是從上皮內(nèi)瘤變階段發(fā)展而來,但目前對于宮頸癌已有大量研究[62-64],對宮頸上皮內(nèi)瘤變的轉(zhuǎn)歸比例及發(fā)展時間都有較明確的結(jié)論。宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)分為3個階段,約有60%的CIN-1自然消退,55%的CIN-2自然消退,28%的CIN-3自然消退,僅有少部分發(fā)生進展[65];且從CIN-3階段發(fā)展到具有侵襲性的宮頸癌需要10～20年。關(guān)于PanIN的轉(zhuǎn)歸比例、發(fā)展時間以及基因調(diào)控途徑尚不明確,但可以確定在PanIN發(fā)展過程中存在復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡,促進PanIN向高級別進展,進而惡化成PDAC[28,66]。HIF-1α在PDAC發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,其與PanIN相關(guān)基因的互相調(diào)控關(guān)系值得深入研究。