臺灣獨蒜蘭炭疽病病原菌的分離與鑒定

柴偉國，方麗，肖文斐，武軍，王漢榮

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310024；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

獨蒜蘭屬(PleioneD.Don)又稱一葉蘭屬，為蘭科(Orchidaceae)多年生草本植物，是國家二級保護(hù)植物，同時被收錄于自2017年10月4日起生效的瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約-附錄二中。獨蒜蘭花形優(yōu)美、色澤鮮艷，有很高的觀賞價值，是國際上享有盛名的觀賞植物[1-2]，同時又有極高的藥用價值。全屬約有20余種，中國分布有16種[3]，其中，獨蒜蘭(P.bulbocodioides)和云南獨蒜蘭(P.bulbocodioides)的假鱗莖經(jīng)炮制后成為“冰球子”，杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)稱為“山慈菇”，是傳統(tǒng)名貴中藥材，有清熱解毒、化痰散結(jié)之效，主要用于治療臃腫療毒、瘰疬痰核、蛇蟲咬傷、癥瘕痞塊[4]。臺灣獨蒜蘭(Pleioneformosana)生于林下或林緣腐殖質(zhì)豐富的土壤和巖石上，海拔600～2 500 m。分布于中國臺灣、浙江、安徽、福建和江西東南部，具有較高的園藝價值。我們在杭州臨安西天目和淳安金紫尖野外發(fā)現(xiàn)臺灣獨蒜蘭，在引種馴化過程發(fā)現(xiàn)葉面出現(xiàn)黑色病斑，疑似炭疽病為害。

植物炭疽病是農(nóng)作物、園藝作物經(jīng)常發(fā)生的一大病害，不同植物的炭疽病，其病原菌有所不同，主要由半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬(Colletotrichum)中的真菌引起[5-8]。炭疽病是蘭科植物的重要病害，施祖榮等[9]發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)墨蘭炭疽病由C.boninese和C.gloeosporioides侵染引起、大花蕙蘭炭疽病僅由C.gloeosporioides侵染引起。唐祥寧等[10]發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)大花蕙蘭炭疽病由C.cymbidiumAllesch.侵染引起。為明確臺灣獨蒜蘭炭疽病的病原菌，特開展本研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中以浙江淳安金紫尖野生臺灣獨蒜蘭(Pleioneformosana)引種馴化過程中發(fā)生的炭疽病病株為試驗材料。

1.2 樣品觀察與鏡檢

6—7月病害發(fā)生時，對受檢樣品的病害癥狀進(jìn)行觀察和整理，取部分典型病樣進(jìn)行顯微鏡檢，分析病害的類型。

1.3 病原菌分離及純化

采用組織分離法對病原菌進(jìn)行分離，將葉片浸泡在70%乙醇中1 min進(jìn)行表面消毒，無菌水浸洗3次后晾干，在樣品病斑的病健交界處用滅過菌的剪刀剪取5 mm2大小的組織塊，用滅菌的鑷子夾至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長出之后挑取生長外緣的菌絲塊轉(zhuǎn)至新的PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株純化。

1.4 病原菌形態(tài)觀察

病原菌經(jīng)顯微觀察后根據(jù)形態(tài)進(jìn)行劃分，每一個病原菌類型選取代表性菌株作為供試菌株，進(jìn)行進(jìn)一步分析。將純化好的典型菌株轉(zhuǎn)至PDA平板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，對病原菌的菌落形態(tài)、孢子形態(tài)大小及顏色進(jìn)行觀察描述并拍照。

1.5 病原菌rDNA-ITS序列的測定

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對典型菌株進(jìn)行DNA提取，并針對其核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間(rDNA-ITS)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為ITS1/ITS4 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TC CTCCGCTATTGATATGC-3′)。將PCR產(chǎn)物送至上海生物有限公司進(jìn)行純化并測序，并通過GenBank基因序列庫內(nèi)序列信息進(jìn)行比對，獲取菌種信息。

1.6 病原分離物致病性測定

病原分離物接種于PDA液體培養(yǎng)基25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)5 d后，收集孢子懸浮液并調(diào)至每毫升106個孢子。用針扎傷葉尖，并均勻噴霧葉片至葉片濕潤不滴液。在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中12 h光照/12 h黑暗保濕培養(yǎng)48 h后，置于室溫自然光下，每天觀察病斑發(fā)生情況。葉片發(fā)病后，再次將病斑切片，鏡檢孢子結(jié)構(gòu)，并從病斑中分離病原菌，比對確定致病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 獨蒜蘭病樣的病原菌分離

2.1.1 獨蒜蘭病癥

病斑自獨蒜蘭葉尖最先發(fā)病，發(fā)病初期葉尖褪綠發(fā)黃，病斑棕褐色，自葉尖向葉片擴(kuò)展，有時有輪紋，病健交界處有明顯黃暈，嚴(yán)重時整株死亡(圖1)。

2.1.2 獨蒜蘭病樣的病原菌分離觀察

采集獨蒜蘭病葉樣品，病健部消毒后取23個小樣。用PDA培養(yǎng)基分離后，獲得的病原分離菌外觀相似。純化這些分離物后，獲得18個病原分離物。這些分離物在新的PDA培養(yǎng)基上呈灰白色，毛絨狀，菌絲茂盛，培養(yǎng)2周后菌落變深灰色可產(chǎn)生大量散生的橘紅色分生孢子堆。各分離物的培養(yǎng)形態(tài)一致。對分生孢子進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)分生孢子無色、單孢、表面光滑、圓柱形、兩端鈍圓，大小10.15～14.66 μm×4.4～6.2 μm；分生孢子器90～180 μm，未見剛毛。初步判斷為炭疽病菌(圖2)。

2.2 獨蒜蘭病原分離物的鑒定

選擇4個典型菌株的rDNA-ITS序列PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測長度約為500 bp，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測序。測序所得546 bp序列，與GenBank內(nèi)信息進(jìn)行BLAST比對，與果生刺盤孢菌(ColletotrichumfructicolaMT476840)相似度達(dá)100%(表1)。進(jìn)一步證明引起獨蒜蘭葉部病癥的致病菌可能為果生刺盤孢菌。

表1 送檢病樣分離物的ITS比對

2.3 病原分離物致病性測定

獨蒜蘭葉片進(jìn)行噴霧傷口接種后，傷口處最初無明顯病斑。接種1個月后，傷口處僅具有少許發(fā)黃癥狀，而葉尖處可見明顯的枯黃癥狀，對照健康無病癥。因此，病原分離物具有很強的潛伏性，致病力較弱，適宜從排水孔(或氣孔)中侵染進(jìn)入。致病性接種照片如圖3所示。按照柯赫氏法則驗證原則，從傷口處分離到相同的病原分離物。因此，果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)為獨蒜蘭炭疽病的病原菌。

3 結(jié)論與討論

臺灣獨蒜蘭原產(chǎn)亞熱帶高海拔地區(qū)，喜涼爽、通風(fēng)的半陰環(huán)境[11-12]，在引進(jìn)栽培過程中葉斑病、炭疽病是主要病害[13-14]，特別在6—7月高溫多雨季節(jié)。在我們引種馴化栽培時，發(fā)現(xiàn)病斑先從葉尖向根莖處延伸，初為褐色，然后逐漸擴(kuò)大增多，出現(xiàn)許多干黑點，嚴(yán)重時導(dǎo)致整株死亡。通過采集23個病葉小樣，分離純化獲得18個病原分離物。通過病原菌形態(tài)觀察和4個典型菌株的rDNA-ITS序列的測定與對比，確定均為果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)感染引進(jìn)的炭疽病，說明杭州地區(qū)臺灣獨蒜蘭6—7月葉部主要病害為炭疽病，為病害防治提供理論指導(dǎo)。

炭疽病病原菌形態(tài)分類的特征有分生孢子和附著胞的形態(tài)大小，分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)大小，剛毛、菌核和厚垣孢子的有無及形態(tài)等。分生孢子用于分類的特征包括孢子形態(tài)[15-16]、有無附屬絲[17]和孢子大小等。由于病原菌菌落形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件影響，單獨依靠形態(tài)特征進(jìn)行不一定能準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，已有多種成熟技術(shù)可以進(jìn)行分類鑒定[18]。ITS序列分析是炭疽菌分類鑒定中應(yīng)用最早的方法，早在1992年Mills等[19]采用ITS1序列分析鑒定了侵染熱帶水果的膠孢炭疽(C.gloeosporioides)菌株。由于ITS鑒定快速，分析準(zhǔn)確，有效彌補了傳統(tǒng)鑒定方法的不足，得到了廣泛應(yīng)用，在本研究中也取得了良好的效果，通過測序結(jié)果可知，僅有1個生理小種，與云南墨蘭炭疽病發(fā)病情況相似[20]，與前期預(yù)期的多個生理小種復(fù)合感染不同。