激素和天然添加物對大籽雪膽生根的影響

字胡潤，趙艷娟，蘇娟，符雨帆，管世超，文鳳，李靖瑞，岳健，*

(1.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650506；2.云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 650229)

雪膽是雪膽屬(HemsleyaCogn.)葫蘆科(Cucurbitaceae)植物的塊莖，主要分布在我國西南部至中南部，是多年生攀援草本，其塊莖可入藥。雪膽屬植物共有31個種，其中包括大籽雪膽(Hemsleyamacrosperma)、中華雪膽(Hemsleyachinensis)、蛇蓮(Hemsleyasphaerocarpa)和浙江雪膽(Hemsleyazhejiangensis)等種類[1]，本實驗以大籽雪膽(H.macrosperma)幼苗作為實驗材料，大籽雪膽又名羅鍋底、苦金盆，塊根膨大成扁圓形，多在溫暖、陰濕處生長，是被記載的云南民間傳統(tǒng)用藥。

雪膽含有的藥用活性成分主要包括雪膽甲素、雪膽乙素、竹節(jié)參皂苷(IVA)和齊墩果酸等，具有抗菌、抗炎和抗癌等功效[2-3]，在防治胃十二指腸潰瘍[4]、抗人類免疫缺陷病毒(HIV)等方面有良好表現(xiàn)[5]，現(xiàn)有研究初步證明了雪膽藥用成分廣泛的應(yīng)用前景。

中成藥雪膽素片和雪膽素膠囊等都以雪膽作為原材料生產(chǎn)，除療效良好外，服用劑量和副作用較小，是云南的特色中藥制劑[6]。傳統(tǒng)醫(yī)藥雪膽素片與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合產(chǎn)生了廣闊的醫(yī)療前景，雪膽素片聯(lián)合阿霉素使用能有效增強(qiáng)細(xì)胞免疫原性死亡從而有抗肝癌作用[7]。臨床研究[8]發(fā)現(xiàn)，雪膽素片與鹽酸依匹斯汀膠囊聯(lián)合使用，對治療慢性蕁麻疹有較好療效。

隨著對雪膽藥用效果的進(jìn)一步深入研究，近年來市場對雪膽的需求量不斷增加，但因為雪膽屬植物自然生長較慢且繁殖系數(shù)較低，傳統(tǒng)種植主要是通過種子和塊莖切段繁殖，種生苗和實生苗都需要生長2 a左右才能移植到大田中栽培，4～5 a后收獲[9]。同時，雪膽屬植物的野生資源較少，難以滿足日益增長的需求，過度開發(fā)給自然生態(tài)資源保護(hù)帶來了壓力。所以，經(jīng)組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖后，再進(jìn)行人工栽培成為大量生產(chǎn)雪膽的有效技術(shù)[10]。在對浙江雪膽的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的α-萘乙酸(NAA)與細(xì)胞分裂素(6-BA)對其生長發(fā)育影響較大，且二者混配對提高繁殖系數(shù)有積極作用[8]。在對峨眉雪膽組織培養(yǎng)體系的研究中發(fā)現(xiàn)，最佳外植體和誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合是葉片和基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS)+1.0 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA[11]。此外，對于雪膽組織培養(yǎng)技術(shù)的探索較少，因此，對雪膽培養(yǎng)基進(jìn)一步研究是后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)雪膽的重要基礎(chǔ)。

在實際生產(chǎn)中，大籽雪膽幼苗在前期組織培養(yǎng)中易出現(xiàn)根部膨大明顯成塊狀，無有效根的問題，直接影響后續(xù)大籽雪膽幼苗的生長發(fā)育。因此，設(shè)計含不同濃度激素及不同含量天然添加物的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗，以大籽雪膽幼苗的根長勢正常(不膨大)且每棵苗有3條有效根為優(yōu)化合格指標(biāo)，為解決大籽雪膽幼苗在組培中的質(zhì)量和生長問題及探究最適宜的雪膽苗培養(yǎng)基提供了試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

云南青谷生物科技有限公司生產(chǎn)培養(yǎng)室苗齡為30 d的大籽雪膽生根苗，長勢正常，葉片為綠色，根的長勢正常，成條狀。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

每個配方配制1 L培養(yǎng)基，每瓶灌裝50 mL，培養(yǎng)基的pH值為6.0，灌裝好后放入滅菌鍋內(nèi)，壓力為0.12 MPa，溫度保持在122 ℃，滅菌30 min后取出培養(yǎng)基放入預(yù)培養(yǎng)室培養(yǎng)5～7 d，選取穩(wěn)定無污染的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗。

1.2.2 接種方法

在超凈工作臺內(nèi)，用滅菌的手術(shù)剪將培育30 d健康的大籽雪膽幼苗剪成莖段，每個莖段包含1個芽點，將莖段接種至制備好的培養(yǎng)基中。

1.2.3 激素及香蕉粉添加物的含量對雪膽生根的影響

雪膽屬植物培養(yǎng)所用的生長調(diào)節(jié)劑NAA的濃度和比例均有所不同，NAA含量會直接影響根的生長[10]，在培養(yǎng)基中不同含量的天然添加物也會影響雪膽生根。本研究以MS為對照，以NAA、香蕉粉濃度和活性炭為變量，設(shè)置不同處理(表1)，每個處理各5瓶50 mL的培養(yǎng)基，每瓶轉(zhuǎn)接12個含1個芽點的莖段，重復(fù)4次。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計根部膨大、生根及苗的生長情況，調(diào)查平均根部膨大直徑、生根率、有效根數(shù)和苗高。

表1 處理組及對照組培養(yǎng)基各組分含量

1.2.4 培養(yǎng)條件

大籽雪膽幼苗培養(yǎng)室的條件為光照2 500 lx、濕度30%左右、溫度(21±3)℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NAA對大籽雪膽幼苗生根的影響

在培養(yǎng)30 d后，不同濃度的NAA對大籽雪膽幼苗的影響見表2。由第5組、第7組及第8組和對照組數(shù)據(jù)可知，大籽雪膽幼苗的生根率和有效根數(shù)隨著NAA濃度的增加而提高，在NAA濃度為0.5 mL·L-1時生根率最高，有效根數(shù)高達(dá)8.0條。由第6組、第8組和對照組來看，雪膽根部的異常膨大與激素NAA的添加關(guān)系不大，與活性炭的添加關(guān)系較大。但在第8組中，在添加活性炭的情況下，大籽雪膽幼苗根部仍然出現(xiàn)了先膨大再長根的異常情況，所以其根部的膨大可能與NAA和活性炭的比例有關(guān)系。

表2 激素和天然添加物對大籽雪膽幼苗生根的影響

同時，在培養(yǎng)30 d后對大籽雪膽幼苗的株高和顏色的觀察中發(fā)現(xiàn)，添加不同激素NAA對雪膽幼苗上半部分生長影響不大，雪膽幼苗株高均在7.60 cm以上。實驗結(jié)果表明，活性炭明顯影響大籽雪膽幼苗上半部分的生長，未添加活性炭的處理在30 d生長狀況與對照組幼苗情況相似，幼苗都較矮，且葉片顏色偏黃(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)接30 d后大籽雪膽幼苗生長狀況

2.2 香蕉粉含量對大籽雪膽幼苗生根的影響

在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用香蕉粉代替激素NAA和吲哚丁酸(IBA)進(jìn)行組織培養(yǎng)，30 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計，不同濃度的香蕉粉對大籽雪膽幼苗的影響見表2。在有活性炭添加的情況下，添加香蕉粉對雪膽幼苗生根有促進(jìn)作用，添加0.3 g·L-1香蕉粉時，雪膽幼苗的生根狀況最好，生根率高達(dá)96.3%，有效根條數(shù)為4.2條。第3組未添加活性炭處理組的雪膽幼苗出現(xiàn)了與對照組相同的根部異常膨大的情況，這表明香蕉粉的添加對大籽雪膽幼苗的根部膨大沒有影響。并且，香蕉粉的添加量不同對雪膽幼苗的上半部分的生長影響并不大，添加不同濃度的香蕉粉，培養(yǎng)30 d時雪膽幼苗的株高均在8.00 cm以上。然而，在未添加活性炭的組別中，幼苗的后續(xù)生長嚴(yán)重受阻，苗高較低，且葉色偏黃，和添加NAA處理中未添加活性炭及對照組的2個處理組結(jié)果相似，所以活性炭有無可能是導(dǎo)致大籽雪膽幼苗根部是否異常膨大的關(guān)鍵因素之一。

3 結(jié)論與討論

許多研究[12-13]報道了雪膽苗培養(yǎng)基配方，以及在組織培養(yǎng)中香蕉粉的添加有益于植物生長，唐軍榮等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在金線蓮組培培養(yǎng)基中添加香蕉粉有壯苗效果，陳志等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在鐵皮石斛培養(yǎng)中添加香蕉粉可促進(jìn)種苗生長，并且可以規(guī)避因香蕉成熟度不一而導(dǎo)致的種苗質(zhì)量不一，同時還可以降低實際生產(chǎn)的成本。本試驗采用全量MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，大籽雪膽幼苗的生根率和有效根數(shù)隨著NAA濃度的增加而提高，雪膽幼苗株高均在7.60 cm以上。然而，在用香蕉粉代替激素NAA和IBA，添加0.3 g·L-1活性炭時，雪膽幼苗生根及生長情況最好，幼苗的生根率達(dá)到96.3%，有效根條數(shù)為4.2條，根部正常發(fā)育成條狀，不出現(xiàn)異常膨大，同時，添加了不同濃度的香蕉粉后，雪膽幼苗的株高均在8.00 cm以上，是較為適宜的培養(yǎng)基配方，初步解決了大籽雪膽幼苗在生產(chǎn)中發(fā)生根部膨大，幼苗發(fā)育不正常的問題。大籽雪膽幼苗根部膨大與香蕉粉的添加無關(guān)，而是與活性炭以及活性炭和NAA的比例有關(guān)，為后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方和大籽雪膽幼苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了重要的依據(jù)。

先前研究[16-18]中明確了活性炭在組織培養(yǎng)中的積極作用，如在防治褐化、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基激素比例、清除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)和促進(jìn)生根等方面有良好作用，這可能與活性炭的強(qiáng)吸附作用有關(guān)。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，活性炭在大籽雪膽幼苗的組織培養(yǎng)中具有積極作用，能有效解決大籽雪膽幼苗在組織培養(yǎng)中根部膨大的問題，但對培養(yǎng)基中最優(yōu)的活性炭添加量仍然缺少研究。在本試驗第8組中，添加了適量活性炭的情況下，仍然由于NAA含量的升高，出現(xiàn)了大籽雪膽幼苗根部膨大的情況，猜測可能是因為NAA的高濃度，導(dǎo)致活性炭的吸附作用無法發(fā)揮，這與前人研究[19]中所報道在培養(yǎng)基中活性炭對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的吸附有所聯(lián)系，但NAA和活性炭二者在培養(yǎng)基里的最優(yōu)比例關(guān)系，及活性炭在雪膽苗組織培養(yǎng)中調(diào)節(jié)根部膨大的具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探索。

在組織培養(yǎng)中，對雪膽屬植物最優(yōu)培養(yǎng)基的探索是符合市場需要和發(fā)展的必然需求，但現(xiàn)有文獻(xiàn)報道較少，僅有在浙江雪膽(H.zhejiangensis)和蛇蓮(H.sphaerocarpa)等有部分研究，在最適培養(yǎng)基、最佳激素添加種類和最優(yōu)天然添加物等方面仍然有待研究。本試驗以較少文獻(xiàn)報道的大籽雪膽作為研究材料，為探究最適宜的大籽雪膽幼苗生長培養(yǎng)基、解決實際生產(chǎn)中出現(xiàn)的大籽幼苗根部膨大問題、提高大籽雪膽幼苗的質(zhì)量和規(guī)?；a(chǎn)雪膽提供了重要依據(jù)，為雪膽進(jìn)一步的生產(chǎn)應(yīng)用和野生資源的保護(hù)奠定基礎(chǔ)。