H5藍莓組培快繁技術(shù)研究

王 巖，陳新華

（沈陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧 沈陽 110034）

藍莓為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（VacciniumSPP.）落葉灌木，果實色澤呈藍紫色，因其果肉細膩，味道酸甜適度，香氣宜人而深受大眾喜愛。藍莓中富含花青素，不僅具有很強的抗氧化抗衰老活性，同時對高血壓、高血脂等疾病具有顯著的預(yù)防與抑制作用。我國自20 世紀80 年代引入藍莓栽培品種以來，經(jīng)過40 年的發(fā)展，藍莓產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)供需兩旺的健康發(fā)展態(tài)勢。遼寧省處于寒溫地區(qū)，具有發(fā)展藍莓產(chǎn)業(yè)得天獨厚的優(yōu)勢，2020 年遼寧省藍莓栽培面積已達7 800 hm2［1］。傳統(tǒng)的藍莓栽培以露天栽培為主，栽培品種常選用耐寒性強的晚熟品種。隨著人民生活水平的提高，藍莓鮮果反季節(jié)需求持續(xù)增加，篩選和推廣蓄冷量低的早熟品種，通過設(shè)施栽培實現(xiàn)鮮果提前上市成為藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展新趨勢［2］。

H5 藍莓為南高叢品種，具有生長旺盛，枝干微開張，分枝多冠幅大，早掛果產(chǎn)量高，果實大口感好等優(yōu)點；而且H5 藍莓需冷量僅需50 h，休眠時間短，是適合設(shè)施化反季節(jié)栽培的極早熟品種。以H5藍莓為研究材料，從外植體消毒、基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇、激素種類和配比等因素對腋芽萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)、不定根分化等方面進行研究，為H5 藍莓組織培養(yǎng)技術(shù)提供技術(shù)支持［3-4］。

1 研究材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為H5 藍莓當年生半木質(zhì)化枝條，要求枝條生長健壯、無病蟲害。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同消毒劑組合對外植體消毒效果的影響

將半木質(zhì)化的當年生枝條剪成2 cm 的莖段，每個莖段帶有1 個腋芽，先用中性洗衣液溶液浸泡約5 min，并用軟毛刷清洗外植體表面污漬，流水沖洗25～30 min。外植體分別用75%酒精消毒30 s 或1%次氯酸鈉消毒10 min，然后用0.1%升汞溶液浸泡消毒一定的時間，并用無菌水沖洗5 次。將消毒后的外植體兩端分別切除0.2 cm，接種于MS 培養(yǎng)基中，每瓶接種外植體1 個，每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)接種20 瓶。在25 ℃，光照強度2 500 lx，光照時間16 h/d 的條件下培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計污染率、成活率［5-6］。

1.2.2 不同pH 值對H5 藍莓外植體腋芽增殖倍數(shù)的影響

配制MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 值分別調(diào)至5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和2 mg/L 玉米素（ZT）。將消毒后的外植體分別接種于不同pH 值的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)接種20 瓶。在溫度25 ℃、光照強度2 500 lx、光照時間16 h/d 的條件下培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計分枝數(shù)和腋芽數(shù)［7-8］。

1.2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對H5藍莓腋芽增殖倍數(shù)的影響

配制MS、1/2 MS、White、B5、改良WPM 5 種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將pH 值調(diào)至5.4，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和2 mg/L 玉米素（ZT）。將消毒后的外植體接種于不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每個處理應(yīng)重復(fù)3 次，每個重復(fù)應(yīng)接種20 瓶。在溫度為25 ℃、光照強度為2 500 lx、光照時間為16 h/d 的條件下培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計分枝數(shù)和腋芽數(shù)［9］。

1.2.4 不同玉米素濃度對H5 藍莓叢生芽誘導(dǎo)率的影響

以改良WPM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 值調(diào)至5.4，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和一定濃度的玉米素（ZT）。將繼代培養(yǎng)藍莓幼苗切成小段，每段帶有1 個腋芽，將帶有腋芽的莖段接種于不同濃度的玉米素（ZT）培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)接種20 瓶，每瓶接種10 段。培養(yǎng)60 d 后，統(tǒng)計叢生芽誘導(dǎo)率［10-11］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑組合對外植體消毒效果的影響

不同消毒劑組合對外植體消毒效果的影響見表1。不同消毒劑組合和消毒時間對外植體消毒效果影響顯著，隨著消毒時間的延長，污染率顯著下降，同時腋芽的活力也顯著下降。綜合分析外植體的污染率和成活率，0.1%升汞消毒9 min 效果最好，消毒時間較短會導(dǎo)致污染率較高，消毒時間過長導(dǎo)致腋芽活性下降，成活率較低。與75%酒精消毒30 s 相比，1%次氯酸鈉消毒10 min 的效果更好。1%次氯酸鈉消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min的效果最佳，污染率為6.67%，成活率為85.00%。

表1 不同消毒劑組合對外植體消毒效果的影響

2.2 不同pH 值對H5 藍莓外植體腋芽增殖倍數(shù)的影響

不同pH 值對H5 藍莓外植體腋芽增殖倍數(shù)的影響如表2 所示。不同pH 值對H5 藍莓的分枝數(shù)量、分枝高度和腋芽數(shù)均有顯著影響，當pH 值為5.4 時，每個外植體的分枝數(shù)和每個分枝的腋芽數(shù)最多，分別達到4.58、6.45 個，其腋芽增殖倍數(shù)達到29.54 倍。

表2 不同pH值對外植體腋芽誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對H5藍莓腋芽增殖倍數(shù)的影響

不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對H5 藍莓分枝數(shù)和腋芽增殖倍數(shù)的影響較大，結(jié)果見表3。其中1/2 MS 和改良WPM 培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)效果較好，每個外植體平均分枝數(shù)分別達到5.24、5.98 個，但是由于1/2 MS培養(yǎng)基營養(yǎng)相對缺乏，影響分枝正常生長，平均株高只有3.76 cm，分枝的平均腋芽只有4.21 個，在改良WPM 培養(yǎng)基中，每個分枝平均腋芽數(shù)達6.91 個，腋芽增殖倍數(shù)達41.32 倍。因此改良WPM 培養(yǎng)基適于作為H5 藍莓腋芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

表3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對H5藍莓腋芽增殖倍數(shù)的影響

2.4 不同玉米素（ZT）濃度對H5 藍莓叢生芽誘導(dǎo)率的影響

不同玉米素（ZT）濃度對H5 藍莓分枝數(shù)和腋芽增殖倍數(shù)影響顯著，結(jié)果見表4。由表4 可知，在生長素濃度一定的情況下，隨著玉米素（ZT）濃度的增加，對叢生芽的分化具有顯著促進作用，當玉米素濃度達到2.5 mg/L 時，分枝數(shù)量達到最多，每個外植體分化形成6.14 個分枝；玉米素（ZT）濃度繼續(xù)升高，分枝數(shù)不升反降。此外，玉米素（ZT）濃度對分枝的伸長和腋芽分化也有顯著影響，當玉米素（ZT）濃度達到2.0 mg/L 時，分枝平均腋芽數(shù)最多，達6.91 個，其腋芽增殖倍數(shù)也最高，達41.32 倍。

表4 不同玉米素濃度對H5藍莓叢生芽誘導(dǎo)率的影響

3 討論

合適的消毒劑組合和消毒時間是建立植物無菌系的關(guān)鍵。不同植物、不同組織、不同成熟度的外植體，攜帶微生物的種類、數(shù)量不同，對消毒劑的敏感性也不同。本研究選用當年生半木質(zhì)化的健康枝條作為外植體，與成熟木質(zhì)化枝條相比對消毒劑更加敏感。結(jié)果表明，H5 藍莓外植體采用1%次氯酸鈉消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min 時，消毒效果最佳，污染率為6.67%，成活率為85.00%。這與李軍萍等（2011）［12］提出的奧尼爾藍莓外植體最佳消毒方式基本一致。

不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基其無機離子、有機物質(zhì)的組成和濃度存在較大差異［13］。結(jié)果表明，1/2 MS 培養(yǎng)基相比于MS 培養(yǎng)基更適合藍莓生長，這可能是因為藍莓對氮、磷、鉀、鈣、鎂等大量元素需求較少，微量元素濃度高時反而不利于藍莓生長。改良WPM培養(yǎng)基中氮、磷、鉀等大量元素濃度介于MS 和1/2 MS 培養(yǎng)基之間，既能滿足藍莓生長對各營養(yǎng)素的需求，又避免了離子濃度過高產(chǎn)生的抑制作用［14-15］。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，以當年生半木質(zhì)化枝條為外植體時，1%次氯酸鈉消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min 有利于建立H5 藍莓無菌系。以改良WPM 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 值為5.4，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和2.0 mg/L 玉米素（ZT）時，對叢生芽的誘導(dǎo)和腋芽增殖最有利，培養(yǎng)60 d，腋芽增殖倍數(shù)達41.32 倍。