急性腦出血患者腦組織中小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化狀態(tài)與血腫周圍水腫的關系

申學明，韓秀鵬，何 超，唐艷軍，韓 松，閆長祥

(1.安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,河南 安陽 455000;2.安陽市人民醫(yī)院放射科,河南 安陽 455000;3.首都醫(yī)科大學三博腦科醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 100000)

急性腦出血是一種常見的致殘性疾病,具有較高的發(fā)病率、致殘率和病死率[1]。腦出血后數(shù)小時內(nèi)可形成顱內(nèi)血腫和血腫周圍水腫,血腫形成時通過分離切割及壓迫鄰近組織造成的機械性損傷稱為原發(fā)性損傷,目前通過微創(chuàng)手術清除血腫,對挽救大面積腦出血患者取得了一定效果[2],但并未解決腦出血后的繼發(fā)性腦損傷。腦出血的繼發(fā)性損傷與神經(jīng)免疫反應密切相關,炎癥反應對清除血腫至關重要,發(fā)生炎癥反應時釋放的大量促炎因子、趨化因子及細胞毒性物質(zhì)可觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應,引起神經(jīng)元失能及細胞死亡。同時,炎癥反應可促使血管內(nèi)皮細胞凋亡和脫落,導致血腫周圍血腦屏障的完整性被破壞和通透性增加,形成腦水腫。因此,炎癥反應是腦出血后繼發(fā)性損傷的主要原因之一[3]。小膠質(zhì)細胞是腦組織中的固有吞噬細胞,是腦出血后最先激活免疫反應的炎癥細胞;同時,由于血腦屏障完整性的破壞,使血源性巨噬細胞浸潤到損傷部位,二者發(fā)揮相似的功能,均是通過吞噬作用清除細胞碎片,并釋放促炎及抗炎因子,但在細胞形態(tài)上難以區(qū)分,往往統(tǒng)稱為小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞(microglia/macrophage,MG/MP)[4]。激活的MG/MP表現(xiàn)為2種極化表型,分別為促炎的M1型和抗炎的M2型[5]。有研究顯示,MG/MP的極化狀態(tài)可影響血腫的吸收和血腫周圍水腫的形成,與腦出血的預后有一定的相關性[6]。因此,探討MG/MP的極化狀態(tài)及程度對評估腦出血患者的預后有一定意義。本研究對正常腦組織和血腫周圍腦組織中炎癥因子水平及M1型、M2型MG/MP極化水平進行比較,探討急性腦出血患者腦組織中MG/MP的極化狀態(tài)與血腫周圍水腫的關系,以期為急性腦出血患者的病情及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年12月至2022年11月安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的急性基底節(jié)區(qū)腦出血患者為研究對象。病例納入標準:(1)經(jīng)影像學檢查確診;(2)均為原發(fā)性基底節(jié)區(qū)腦出血,且發(fā)病6 h以內(nèi);(3)血腫量>30 mL,由于血腫占位效應導致意識障礙惡化,符合手術指征,采用額顳成形骨瓣顯微鏡下腦內(nèi)血腫清除術;(4)術前未使用糖皮質(zhì)激素、甘油果糖或甘露醇治療。病例排除標準:(1)入院時出現(xiàn)深昏迷;(2)繼發(fā)性腦出血,如由于外傷、溶栓治療、腦腫瘤、動靜脈畸形、腦靜脈系統(tǒng)血栓、血液系統(tǒng)疾病、顱內(nèi)感染和自身免疫性疾病等導致的腦出血;(3)合并嚴重的心、肝、腎功能不全等疾病;(4)出血破入腦室,合并其他部位腦出血。本研究共納入急性腦出血患者52例,男32例,女20例;年齡34～72 (59.27±13.38)歲,發(fā)病至手術時間6 h以內(nèi),血腫量31～77(49.08±19.72)mL。所有患者行額顳成形骨瓣顯微鏡下腦內(nèi)血腫清除術,獲取手術通道上未受血腫侵犯的皮質(zhì)區(qū)正常腦組織和血腫周圍廢棄的破碎腦組織(血腫周圍腦組織),分別置于不同顏色的EP管并進行編號登記,先于液氮中速凍 1 min,然后貯存于-80 ℃冰箱。本研究通過安陽市人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 Western blot法檢測腦組織中白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-10和轉(zhuǎn)化生子因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的蛋白表達

取正常腦組織和血腫周圍腦組織,先進行蛋白樣品制備及蛋白定量檢測(組織細胞總蛋白抽提試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司),蛋白上清經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的一抗滴度為11 000,TGF-β一抗滴度為1200),4 ℃孵育過夜,用含Tween 20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜;加入二抗(滴度為14 000),室溫搖床上孵育2 h。根據(jù)相對分子質(zhì)量大小裁取相應的條帶,經(jīng)X線片曝光、顯影、定影后形成條帶灰度圖像,然后應用Image J軟件進行條帶吸光度分析,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)條帶吸光度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的mRNA表達

取正常腦組織和血腫周圍腦組織,采用TRIzol總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取樣本RNA,然后對樣品總RNA的純度和完整性進行檢測。qRT-PCR采用兩步法進行,首先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,GAPDH為內(nèi)參基因,使用qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行擴增;反應條件為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。IL-1β(擴增片段長度105 bp)上游引物序列為5′-GCACGATGCACCTGTACGAT-3′,下游引物序列為 5′-CCCTGGAGGTGGAGAGCTTT-3′;IL-6(擴增片段長度104 bp)上游引物序列為5′-CCAGTACCCCCAGGAGAAGAT-3′,下游引物序列為5′-CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3′;TNF-α(擴增片段長度96 bp) 上游引物序列為5′-TGAGGCCAAGCCCTGGTAT-3′,下游引物序列為5′-TAGTCGGGCCGATTGATCTC-3′;IL-10(擴增片段長度132 bp)上游引物序列為5′-TTATCTTGTCTCTGGGCTTGG-3′,下游引物序列為5′-GTTGGGGAATGAGGTTAGGG-3′;TGF-β(擴增片段長度113 bp)上游引物序列為5′-CAAGGGCAGCTGTCAGAACA-3′,下游引物序列為5′-GGCAAATTACCACTCGGAAGTT-3′;GAPDH(擴增片段長度95 bp)上游引物序列為5′-GATTCCACCCATGGCAAATT-3′,下游引物序列為5′-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3′。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量,△Ct=目標基因Ct-內(nèi)參基因Ct值(Ct 值代表每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定閾值時所需循環(huán)數(shù))。

1.4 免疫熒光共聚焦技術計數(shù)腦組織中M1型、M2型MG/MP細胞

采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)對細胞核進行染色(陽性為藍色),CD11b蛋白標記MG/MP(陽性為綠色),主要組織相容性復合體-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)標記M1型MG/MP細胞(陽性為紅色),CD206蛋白標記M2型MG/MP細胞(陽性為紅色)。按照說明書設置免疫熒光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)檢測程序,每個組織切片在高倍鏡下選取最明顯的3個區(qū)域,對每個區(qū)域的MG/MP(CD11b陽性)、M1型MG/MP(MHC-Ⅱ和CD11b雙陽性)、M2型MG/MP(CD206和CD11b雙陽性)細胞進行計數(shù)[7],并計算M1型MG/MP和M2型MG/MP細胞占MG/MP細胞的百分比,取均值表示M1型、M2型MG/MP細胞水平。

1.5 血腫周圍水腫程度評估

收集患者手術前的CT影像資料,應用多田公式[8]計算血腫體積及包含血腫的周圍水腫總病灶體積,根據(jù)血腫周圍絕對水腫體積為總病灶體積減去血腫的體積,進而計算血腫周圍相對水腫體積(relative-perihematomal edema,r-PHE)。r-PHE =血腫周圍絕對水腫體積/血腫體積,以r-PHE來代表腦出血患者血腫周圍水腫程度,數(shù)值越大說明水腫程度越嚴重。顱內(nèi)血腫的CT值一般為60～90 Hu,腦水腫的CT值為8～22 Hu。根據(jù)r-PHE將患者分為高r-PHE組(2.0≤r-PHE<2.5)和低r-PHE組(1.5

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 急性腦出血患者血腫周圍腦組織與正常腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β蛋白相對表達量比較

血腫周圍腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量顯著高于正常腦組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);血腫周圍腦組織與正常腦組織中IL-10、TGF-β蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1和表1。

A:正常腦組織;B:血腫周圍腦組織。

表1 急性腦出血患者血腫周圍腦組織與正常腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β蛋白相對表達量比較Tab.1 Comparision of the relative expressions of IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10 and TGF-β protein in brain tissue around the hematoma and normal brain tissue of patients with acute cerebral hemorrhage

2.2 急性腦出血患者血腫周圍腦組織與正常腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β mRNA相對表達量比較

血腫周圍腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量顯著高于正常腦組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);血腫周圍腦組織與正常腦組織中IL-10、TGF-β mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 急性腦出血患者血腫周圍腦組織與正常腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β mRNA相對表達量比較Tab.2 Comparision of the relative expressions of IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10 and TGF-β mRNA in brain tissue around the hematoma and normal brain tissue of patients with acute cerebral hemorrhage

2.3 急性腦出血患者血腫周圍腦組織與正常腦組織中M1和M2型MG/MP水平比較

血腫周圍腦組織中M1型MG/MP和M2型MG/MP水平均顯著高于正常腦組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2、圖3和表3。

A:正常腦組織;B:血腫周圍腦組織; Merge:前3張圖疊加合成。

A:正常腦組織;B:血腫周圍腦組織;Merge:前3張圖疊加合成。

表3 急性腦出血患者血腫周圍腦組織與正常腦組織中M1和M2型MG/MP水平比較Tab.3 Comparison of the levels of M1 and M2 MG/MP between the brain tissue around the hematoma and the normal brain tissue of patients with acute cerebral hemorrhage

2.4 不同r-PHE患者血腫周圍腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的mRNA相對表達量比較

高r-PHE組患者血腫周圍腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量顯著高于低 r-PHE組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);2組患者血腫周圍腦組織中TGF-β、IL-10的mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 低r-PHE組與高r-PHE組患者血腫周圍腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β mRNA相對表達量比較Tab.4 Comparison of the relative expression levels of IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10 and TGF-β mRNA in brain tissue around the hematoma of patients between the low r-PHE group and the high r-PHE group

3 討論

急性腦出血最常見的出血部位是基底節(jié)區(qū),該結(jié)構(gòu)損傷后常伴有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷[9]。本研究選取標本的時間定在發(fā)病6 h內(nèi),與腦出血患者發(fā)病后行急診手術的實際情況相符合,從發(fā)病轉(zhuǎn)運至醫(yī)院,完成影像學檢查和術前準備,到手術的進行,術中取出標本往往就在這個時間段。另外,根據(jù)研究前查閱的資料發(fā)現(xiàn),這個時間段對于腦出血患者來講,腦內(nèi)已發(fā)生了強烈的炎癥反應,所獲得的標本符合課題研究目標的要求。有研究發(fā)現(xiàn),血源性巨噬細胞在出血后4.5 h已浸潤至出血周圍組織,協(xié)同腦內(nèi)固有的小膠質(zhì)細胞引起了局部復雜的免疫炎癥反應[10]。

在腦損傷產(chǎn)生的免疫反應中,小膠質(zhì)細胞和單核細胞來源的巨噬細胞很難區(qū)分,往往統(tǒng)稱為MG/MP,可通過吞噬作用清除細胞碎片,并釋放促炎及抗炎因子。生理狀態(tài)下,MG/MP依靠突觸通過阿米巴運動的方式頻繁移動,對微環(huán)境做到不間斷的監(jiān)測和評估。在病理狀態(tài)下微環(huán)境發(fā)生變化,MG/MP會迅速對變化的環(huán)境做出反應,這種根據(jù)刺激和環(huán)境變化采用不同表型的過程叫做極化[11]。依靠MG/MP在形態(tài)和功能上的動態(tài)性、可塑性調(diào)節(jié),可以對不同病變和病變的不同階段產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用[12]。MG/MP的極化往往形成2種表型,分別為M1型和M2型。M1型MG/MP被認為是促炎型,能產(chǎn)生促炎因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)、趨化因子、一氧化氮等多種物質(zhì),能夠造成神經(jīng)組織的損傷,M1型MG/MP標志物包括MHC-Ⅱ、CD86、CD16和一氧化氮合酶[13]。M2型MG/MP被認為是抗炎型,產(chǎn)生的細胞因子TGF-β能夠調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖、分化,上調(diào)Bcl-2和Bcl-x1的表達;產(chǎn)生的抗炎因子IL-4的存在可以促進抗炎因子IL-10生成,誘導免疫耐受,M2型MG/MP標志物包括CD163、CD206、Arg1、CD36等[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),急性腦出血發(fā)生后,血腫周圍腦組織中的炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的蛋白表達水平明顯升高,其對應的mRNA表達也出現(xiàn)了快速增加,說明迅速啟動了促炎反應的基因轉(zhuǎn)錄,在腦出血急性期MG/MP向M1型極化增強。對于炎癥因子IL-10、TGF-β的蛋白、mRNA表達水平,盡管血腫周圍腦組織與正常腦組織中出現(xiàn)了輕微升高,但在統(tǒng)計學上不具有差異性,考慮腦出血發(fā)生后向M2型的極化還很弱,提示腦出血后的急性期抗炎、修復反應還不明顯,抗炎反應還很弱。

血腫周圍水腫被廣泛用作實驗性腦出血模型的預后評估指標[16]。在腦出血后的幾小時內(nèi),由于血紅蛋白毒性、凝血級聯(lián)反應激活、補體激活和血腦屏障的破壞等因素, 在腦出血的早期就發(fā)生了明顯的神經(jīng)免疫炎癥,而且免疫反應程度與血腫周圍水腫的范圍密切相關。本研究結(jié)果顯示,IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表達量與相對應mRNA的表達具有一致性,與術前CT檢查顯示的相對水腫程度進行對照發(fā)現(xiàn),血腫周圍相對水腫體積較大的患者血腫周圍組織中促炎因子水平也較高。有研究發(fā)現(xiàn),腦出血后出血區(qū)水腫程度與炎癥因子的蛋白、mRNA表達水平等因素有關[17],而局部腦組織水腫情況與腦出血患者遠期預后、神經(jīng)功能惡化程度直接相關,可調(diào)控、阻斷、降低M1型小膠質(zhì)細胞的炎癥因子水平、mRNA表達及轉(zhuǎn)錄,可能對腦出血患者的治療帶來更大益處[18]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),急性腦出血后血腫周圍組織中促炎因子水平明顯升高,提示腦出血急性期出現(xiàn)了明顯的促炎反應,并且M1型MG/MP的極化水平與血腫周圍水腫程度具有明顯的一致性。

現(xiàn)階段對腦出血的研究更多是在動物模型上進行的,缺乏反映患者群體的研究,基于此,作者以急性腦出血患者為研究對象,并嚴格按照醫(yī)學倫理學的要求,對患者不產(chǎn)生額外損傷,通過常規(guī)腦出血手術取得組織標本進行研究,具有一定的現(xiàn)實意義。但本研究仍存在局限性,首先,標本的獲取是在特定的手術時間,在后續(xù)的治療中無法獲得,對MG/MP持續(xù)的極化狀態(tài)缺乏連續(xù)的研究。其次,患者樣本量較小,且缺乏患者預后的長期隨訪數(shù)據(jù),腦出血患者的腦小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)對遠期預后的預測評價有待進一步研究。