五味子乙素對甲狀腺功能亢進(jìn)性心肌病大鼠的影響

王澤琪 高藝花 金玥彤 叢姍姍 金鉉順

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（吉林延吉 133000）

甲狀腺功能亢進(jìn)性心臟?。╤yperthyroidism heart disease， HHD）是甲狀腺激素長期刺激心臟使心室重構(gòu)，心肌細(xì)胞缺血缺氧發(fā)生凋亡、心肌損傷的疾病，臨床常表現(xiàn)為心律失常和心力衰竭等［1-3］。有研究［4-5］結(jié)果表明，炎癥因子NF-κB 與心肌細(xì)胞缺氧時心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。速度向量成像技術(shù)（velocity vector imaging technology，VVI）基于斑點(diǎn)追蹤原理，不受角度影響，反映局部及整體心肌運(yùn)動［6］。N 端腦利鈉肽前體（N-terminal pro-brain nirtiepeptide， NT-proBNP）是心臟壁舒張時釋放到血液中的心臟激素，左右心室功能受損時升高，是重要的心臟標(biāo)志物［7］。五味子乙素（schisandrin B， SchB）有多種藥理作用，其可以有效減少心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌損傷［8-9］。但在HHD 中，SchB 對心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌功能的機(jī)制研究較少。本研究將通過VVI 技術(shù)、血清中NT-proBNP、組織及血清中NF-κB 水平，探討SchB對HHD 大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌功能影響，為SchB 對心肌細(xì)胞凋亡、心肌功能的干預(yù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備本研究經(jīng)延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（NO1.231.32062）。準(zhǔn)備30 只11 周齡雄性SD 大鼠（購于延邊大學(xué)實驗動物中心），體質(zhì)量（310 ± 10）g，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境及飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對照組（CON 組），甲亢模型組（HHD 組），SchB 藥物干預(yù)組（HHD + SC 組）。參照預(yù)實驗及造模文獻(xiàn)方式制備實驗?zāi)Ｐ停?0］，HHD 組及HHD + SC 組均于皮下注射左甲狀腺素0.5 mg/（kg·d）持續(xù)28 d，CON 組注射相同體積生理鹽水，與此同時，HHD + SC 組每天以SchB 稀釋劑80 mg/（kg·d）灌胃，CON 組及HHD 組大鼠以同等體積生理鹽水灌胃。28 d 后終止藥物干預(yù)。

1.2 VVI 技術(shù)檢測于藥物干預(yù)結(jié)束前1 d 禁食、水。腹腔注射30%烏拉坦麻醉后，脫毛膏去除胸前鼠毛，仰臥固定。選取西門子Acuson SC2000 彩色多普勒超聲機(jī)，選擇10V4探頭（頻率10 MHz），對各組行超聲心動圖掃查同時保存數(shù)據(jù)，脫機(jī)后行VVI分析。描記大鼠心尖四腔心切面左室心內(nèi)膜，系統(tǒng)分析縱向收縮期峰值速度（systolic velocity， Vs）、縱向舒張期峰值速度（diastolic velocity， Vd）、峰值應(yīng)變（maximum strain， Smax）、收縮期峰值應(yīng)變率（systolic strain rate， sSRr）和舒張期縱向峰值應(yīng)變率（diastolic strain rate， dSRr）。經(jīng)高年資超聲醫(yī)生測量5 次取平均值。見圖1。

圖1 VVI 技術(shù)分析各組大鼠心肌運(yùn)動Fig.1 VVI analysis of myocardial movement of rats in each group

1.3 血液檢測上述同樣方式麻醉大鼠后，腹主動脈取血，通過ELISA 法檢測大鼠血清內(nèi)TT3、TT4、NT- proBNP 及NF-κB 含量。

1.4 細(xì)胞染色采用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測心肌組織細(xì)胞凋亡。大鼠心肌組織蠟塊切片脫蠟，滴加蛋白酶K 室溫作用20 min，PBS 洗滌，滴加TUNEL 緩沖液，37 °C 避光孵育60 min，PBS 洗滌，DAPI 室溫浸泡15 min，洗滌后用抗熒光淬滅封片液封片后用光鏡觀察大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot 分析大鼠心肌組織于-80 ℃環(huán)境保存，以裂解液提取組織蛋白，據(jù)蛋白定量數(shù)據(jù)配置樣本溶液，水浴加熱后行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，用NF-κB 及相應(yīng)二抗依次孵育，在暗室進(jìn)行顯影定影，掃描X 線片通過ImageJ（2.0 版本）定量蛋白質(zhì)條帶，計算NF-κB 與β-actin 條帶的光強(qiáng)度之比。

1.6 病理學(xué)檢查取血后，胸廓切開取心臟并稱重，取模型左室心肌相同部位1 mm3浸泡于戊二醛溶液中固定。PBS 洗滌，4 ℃保存。用電子顯微鏡查看左室心肌組織細(xì)胞及線粒體形態(tài)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果使用 SPSS 26.0 軟件采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，最終通過均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式標(biāo)注結(jié)果。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VVI技術(shù)評價SchB對大鼠心肌功能的影響與CON 組相比，HHD 組Vs、Vd、Smax、sSR 和dSR 均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與HHD組相比，HHD+SC 組Vs（P＜ 0.01）、Vd（P＜ 0.05）、Smax（P＜ 0.01）、sSRr（P＜ 0.05）及dSRr（P＜ 0.05） 均有升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 大鼠心肌VVI 各項指標(biāo)結(jié)果Tab.1 Results of rat VVI indicators ±s

表1 大鼠心肌VVI 各項指標(biāo)結(jié)果Tab.1 Results of rat VVI indicators ±s

注：與CON組比較，*P ＜ 0.01；與HHD組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01

項目Vs（cm/s）Vd（cm/s）Smax（%）收縮期sSRr（1/s）舒張期dSRr（1/s）P值＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.05＜ 0.05 CON組2.83 ± 0.57 2.73 ± 0.61 23.72 ± 5.84 13.97 ± 3.93 12.17 ± 3.14 HHD組1.56 ± 0.62*1.84 ± 0.35*8.87 ± 2.64*10.02 ± 1.60*8.02 ± 2.75*HHD+SC組2.86 ± 1.27##2.46 ± 0.58#16.49 ± 2.69##13.29 ± 2.38#10.98 ± 1.36#F值8.589 9.115 40.890 7.194 7.946

2.2 SchB 對模型大鼠血清TT3、TT4、NT-proBNP及NF-κB 濃度的影響與CON 組相比，HHD 組血清中TT3（P＜ 0.01）、TT4（P＜ 0.01） 、NT- proBNP（P＜ 0.05）及 NF-κB（P＜ 0.01）含量升高，與HHD組相比，HHD+SC 組血清中 TT3（P＜ 0.05）、TT4（P＜ 0.05）、NT- proBNP（P＜ 0.05）及 NF-κB（P＜0.01）含量下降。與CON 組相比，HHD+SC 組血清中TT3、TT4、NT- proBNP 及 NF-κB 含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表2。

表2 ELISA 檢測大鼠血清結(jié)果Tab.2 ELISA detection of rat serum results ±s

表2 ELISA 檢測大鼠血清結(jié)果Tab.2 ELISA detection of rat serum results ±s

注：與CON組相比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與HHD組相比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01

項目TT3（ng/mL）TT4（ng/mL）NT-proBNP（pg/mL）NF-κB（pg/mL）P值＜ 0.005＜ 0.001＜ 0.005＜ 0.001 CON組4.24 ± 0.45 113.87 ± 30.38 626.94 ± 41.02 23.68 ± 6.34 HHD組5.15 ± 0.73**169.25 ± 32.36**731.23 ± 97.24*44.72 ± 8.23**HHD+SC組4.46 ± 0.52#125.81 ± 32.75#627.04 ± 67.18#30.26 ± 8.78##F值6.933 9.446 7.258 20.555

2.3 SchB對模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，與CON 組相比，HHD 組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多，與HHD 組相比，HHD+SC 組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，見圖2。

圖2 TUNEL 染色示各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（×200）Fig.2 TUNEL staining showed the apoptosis of cardiomyocytes in each group（×200）

2.4 Western blot 分析HHD 組心肌NF-κB 表達(dá)較CON 組增高（P＜ 0.05 ）；與HHD 組相比，HHD+SC 組NF-κB 表達(dá)降低（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測各組大鼠NF-κB 表達(dá)情況Fig.3 The expression of NF-κB in each group was detected by western blot

2.5 電子透射顯微鏡下觀察SchB 對心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的作用CON 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊、線粒體形態(tài)正常且線粒體嵴完整。HHD 組鏡下可見心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂、部分心肌纖維斷裂、線粒體受損水腫、線粒體嵴缺失形成空泡。與HHD 組相比，HHD + SC 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列較整齊接近CON 組、纖維斷裂減少、線粒體水腫緩解、破裂數(shù)明顯下降，見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織電鏡（× 6 000）Fig.4 Electron microscopy of myocardial tissue of rats in each group （× 6 000）

3 討論

HHD 是甲亢患者主要死亡原因之一［11］。長期高水平甲狀腺激素刺激下，通過基因組或非基因組等機(jī)制，一方面影響心臟蛋白合成，另一方面影響心肌細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器的變化，最終使心肌細(xì)胞發(fā)生重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡等改變，使患者出現(xiàn)心律失常及心力衰竭，影響患者生存率及預(yù)后［12-13］。SchB 作為一種天然化合物，其抗炎、抗氧化及抗細(xì)胞凋亡等功能對心肌細(xì)胞有明顯保護(hù)效果［14-15］。

心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加是長期心肌損傷、肥大導(dǎo)致心臟功能惡化出現(xiàn)心力衰竭的重要特征，抑制細(xì)胞凋亡可以延緩心臟功能惡化，并可能防止進(jìn)展為心力衰竭［13］。甲亢診斷中，血清TT3、TT4濃度是特異性指標(biāo)且常用于指導(dǎo)治療［16］。NT-proBNP 是診斷心力衰竭的重要生物標(biāo)志物［17］。心肌細(xì)胞凋亡參與很多心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，是心力衰竭重要的病理基礎(chǔ)［18］。KARABULUT等［19］研究發(fā)現(xiàn)，NT-proBNP 水平與心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)聯(lián)及預(yù)后有重要意義，心肌細(xì)胞凋亡程度與NT-proBNP 含量成正相關(guān)。本研究中，與CON 組相比，HHD 組的血清 TT3、TT4 含量升高，TUNEL 染色顯示心肌細(xì)胞凋亡陽性顆粒明顯增加，電鏡觀察大鼠的心肌組織可見HHD 組較CON組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂、心肌纖維斷裂數(shù)量增多、受損線粒體增多，證明HHD 大鼠模型建立成功且HHD 大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，與BAO等［1］研究結(jié)果一致。HHD 組血清NT-proBNP 含量與CON 組相比增高，與目前研究一致［19］，提示HHD 大鼠出現(xiàn)心力衰竭且血清NT-proBNP 含量改變與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。

NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)多種反應(yīng)過程，尤其是參與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)通路，長期的高水平甲狀腺激素激活心肌細(xì)胞中NF-κB，參與心肌細(xì)胞凋亡過程［20-22］。本研究中，與CON組相比，HHD 組血清中NF-κB 濃度與組織中NFκB 表達(dá)增高，提示長期甲狀腺激素作用致體內(nèi)與NF-κB 相關(guān)的凋亡系統(tǒng)處于一種活躍階段，結(jié)合電鏡及TUNEL 染色結(jié)果心肌細(xì)胞凋亡也正處于激活狀態(tài)，提示HHD 大鼠心肌細(xì)胞凋亡可能由NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與，且血清NF-κB 水平與TT3、TT4 濃度呈正相關(guān)，證明甲亢嚴(yán)重程度與心肌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。

本實驗中，與HHD 組相比，經(jīng)SchB 治療后HHD+SC 組血清TT3、TT4 含量降低，電鏡示HHD+SC 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂程度好轉(zhuǎn)、心肌纖維斷裂數(shù)量減少、受損線粒體減少，TUNEL 染色顯示心肌細(xì)胞凋亡陽性顆粒顯著減少，提示SchB 可改善HHD 大鼠心肌細(xì)胞損傷并且抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡。HHD+SC 組血清NT-proBNP 含量下降提示SchB 可緩解HHD 大鼠心力衰竭。HHD+SC 組血清NF-κB 濃度、組織中NF-κB 表達(dá)量降低，提示SchB 可減少HHD 大鼠心肌細(xì)胞凋亡及緩解其心力衰竭。

超聲心動圖是評估心臟功能的主要檢查手段，其中 VVI 是近年來研究心肌結(jié)構(gòu)力學(xué)和分析局部心功能的新興技術(shù)，是對心肌運(yùn)動功能量化的分析軟件，不受組織多普勒頻移影響、不受聲束方向與壁面運(yùn)動夾角影響，能顯著提高對心肌運(yùn)動評估的準(zhǔn)確性，易操作、可重復(fù)，能更全面、準(zhǔn)確地定量評價心機(jī)局部及整體功能［23-25］。Vs、Vd、Smax、sSRr 和dSRr 反映心肌收縮、舒張功能。本研究中，與CON 組相比，HHD 組Vs、Vd、Smax、sSRr及dSRr 均減低，提示HHD大鼠心肌運(yùn)動功能受損。與HHD 組相比，HHD+SC 組Vs、Vd、Smax、sSRr 及dSRr 均有升高，組間差異與電鏡及TUNEL 染色結(jié)果相符，提示HHD 中心肌細(xì)胞凋亡程度與心肌收縮舒張功能負(fù)相關(guān)，與心肌細(xì)胞損傷程度正相關(guān)，說明SchB 對心肌存在保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NF-κB 表達(dá)量有關(guān)。

綜上所述，HHD 大鼠心肌細(xì)胞凋亡，心肌運(yùn)動減弱，其機(jī)制可能與心肌NF-κB 過表達(dá)有關(guān)。SchB 可以抑制HHD 大鼠心肌細(xì)胞凋亡，具有改善心肌損傷及緩解HHD 所致大鼠心肌運(yùn)動障礙的作用，其潛在機(jī)制可能與NF-κB 表達(dá)減少有關(guān)。然而，SchB 對HHD 抗凋亡相關(guān)NF-κB 信號通路需進(jìn)一步研究。

【Author contributions】WANG Zeqi： the first author， responsible for data recording and processing， experimental data analysis， article writing. GAO Yihua： corresponding author， responsible for the financial support， experimental design concept，guidance of the article writing. JIN Yuetong， CONG Shanshan： responsible for assisting experimental operation. JIN Xuanshun：responsible for some theoretical guidance. All authors read and approved the final manuscript as submitted.