基于NGF/TrKA/TRPV1通路探討電針改善功能性消化不良大鼠胃高敏感性

金舒文 劉偉 劉嘉寶 范建超 韓永麗 周麗 徐派的 張紅星

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院（武漢 430061）；武漢市第一醫(yī)院2骨科，3針灸科，4康復(fù)科（武漢 430030）

功能性消化不良（FD）是常見的功能性胃腸病，內(nèi)臟高敏感性是引起FD 上腹疼痛的重要病理因素，與餐后飽脹、早飽癥狀相關(guān)［1-2］。越來越多的研究證實(shí)肥大細(xì)胞激活的神經(jīng)生長因子（NGF）/原肌球蛋白受體激酶（TrkA）/瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）通路在內(nèi)臟高敏感性的病理發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用［3-4］。在胃腸道黏膜，聚集于感覺神經(jīng)末端的肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放NGF，與其受體TrKA 結(jié)合后，增強(qiáng)TRPV1 表達(dá)并促進(jìn)其敏化［5］。敏化后的TRPV1 釋放多種神經(jīng)肽如降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP），導(dǎo)致敏感性增高，進(jìn)而誘發(fā)上腹痛、惡心等癥狀［6］。且在臨床研究［7-8］中發(fā)現(xiàn)FD 患者相比于健康人胃黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量上升、脫顆粒增加，TRPV1 表達(dá)升高。盡管目前已證實(shí)電針可顯著改善FD大鼠胃高敏感性［9-10］，但尚無研究探討電針對關(guān)鍵通路NGF/TrkA/TRPV1 在FD 中的作用。因此，本研究旨在觀察電針對FD 大鼠胃組織肥大細(xì)胞介導(dǎo)的NGF/TrkA/TRPV1 通路的影響，探討電針改善胃高敏感性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入SPF 級雄性7 d 齡SD 幼鼠30 只，體質(zhì)量（20 ± 5） g，許可證號：SYKK（鄂）2018-0104。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)期間遵循《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，倫理審批號：HUCMS201805001。

1.2 主要儀器和設(shè)備主要試劑：NGF 抗體、TrKA抗體及TRPV1 抗體（博奧森），CGRP 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（建成），碘乙酰胺（阿拉丁試劑），主要儀器設(shè)備：韓式穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），一次性無菌針灸針（吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司），ProtocolPlusDeluxe9.6R 數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)（加拿大G&J Electronics 公司），電泳儀（北京市六一儀器廠），熒光定量PCR 儀（Bio-rad），光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯）。

1.3 模型制備采用碘乙酰胺溶液灌胃+不規(guī)則飲食+郭氏夾尾刺激法的多因素干預(yù)方式造模［10］。用0.1%碘乙酰胺混合液對10 d 齡大鼠灌胃，每次0.2 mL，每天1 次，共6 d；空白組予以2%蔗糖溶液等劑量灌胃。3 周齡時(shí)，對造模大鼠隔天喂食；7 周齡時(shí)予以郭氏夾尾刺激，每次30 min，每天2 次，2 次間隔4 h 以上，共7 d。以大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯，進(jìn)食量顯著減少，大便稀溏等為主要特征，且胃腸組織未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變，提示造模成功。

1.4 干預(yù)措施電針組：選取雙側(cè)足三里穴。0.28 mm × 25 mm 一次性無菌針灸針針刺雙側(cè)足三里穴后連接韓式穴位神經(jīng)刺激儀，頻率2 Hz/100 Hz，強(qiáng)度1 mA，每天1 次，每次20 min，連續(xù)干預(yù)14 d。抑制劑組：予以NGF 抑制劑anti-NGF，濃度1∶2 000，1 mg/kg 腹腔注射，每天1 次，連續(xù)干預(yù)14 d［11］。電針+抑制劑組：予以抑制劑腹腔注射，30 min 后電針治療，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.5 取材干預(yù)結(jié)束后，隔夜禁食，予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉。剪取部分胃底組織置于-80 ℃冰箱凍存。另取部分胃底組織置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 一般情況觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛色和大便性狀。在基線期、造模后、干預(yù)后，對大鼠進(jìn)行稱重，記錄大鼠體質(zhì)量變化。

1.6.2 胃順應(yīng)性和高敏感性術(shù)前禁食不禁水12 h，麻醉后，將連接聚乙烯管的球囊經(jīng)食道置入于胃中。待大鼠蘇醒后，以20、40、60、80 mmHg 的梯度分階段增加球囊壓力，每次持續(xù)30 s，后釋放壓力至0 mmHg，3 min 后進(jìn)行下一梯度加壓。Protocol Plus Deluxe 9. 6R 系統(tǒng)監(jiān)測并記錄胃內(nèi)氣囊容積，記錄大鼠腹壁回撤反應(yīng)（AWR）評分。氣囊內(nèi)容積/壓力表示胃順應(yīng)性［12-13］。以各壓力階段大鼠AWR 評分表示胃高敏感性［14-15］。

1.6.3 胃組織病理學(xué)將4%多聚甲醛中固定的胃底組織進(jìn)行梯度脫水，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟后，用蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織形態(tài)。

1.6.4 胃組織肥大細(xì)胞數(shù)量及脫顆粒用1%甲苯胺藍(lán)溶液染色30 min，冰醋酸分化透明，樹膠封固。光鏡拍照，400 倍視野下每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)部位計(jì)數(shù)并取平均值。肥大細(xì)胞脫顆粒率=肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù)× 100%。

1.6.5 免疫組化法檢測胃組織TRPV1 陽性表達(dá)取凍存的大鼠胃組織，進(jìn)行包埋、切片、脫蠟后，進(jìn)行抗原活化、封閉，孵育一抗、二抗，室溫DBA 顯色，蘇木素復(fù)染封片。Image-pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)分析平均光密度值。

1.6.6 蛋白免疫印跡法檢測胃組織NGF、TrkA、TRPV1 蛋白表達(dá)提取總蛋白，測定濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜后加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，清洗3 次，加入二抗（1∶1 500）孵育30 min，清洗4 次，ECL 發(fā)光法顯色，軟件分析條帶吸光度。

1.6.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測胃組織CGRP 表達(dá)量嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測胃組織中CGRP 的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和圖像分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況和體質(zhì)量情況比較一般情況比較：空白組大鼠精神良好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量增長，糞便干燥。造模后，模型大鼠精神萎靡，活動(dòng)量減少，毛發(fā)枯黃，體質(zhì)量增長緩慢，糞便呈黃綠色稀糊樣，有酸腐臭味。干預(yù)后，電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠精神好轉(zhuǎn)，活動(dòng)增加，毛發(fā)黃白相間，體質(zhì)量較前明顯增長，糞便呈成形軟便。

體質(zhì)量比較：造模后，造模大鼠體質(zhì)量顯著低于空白組（P＜ 0.05）。干預(yù)后，電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠體質(zhì)量均高于模型組大鼠（P＜ 0.05），低于空白組（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Tab. 1 Comparison of body mass of rats in each group x±s，g

2.2 胃順應(yīng)性和敏感性比較球囊壓力20 mmHg時(shí)，各組大鼠胃球囊體積/壓力和AWR 評分無顯著差異（P＞ 0.05）。當(dāng)壓力為40 mmHg 時(shí)，與空白組相比，模型組大鼠球囊體積/壓力顯著降低、AWR評分顯著升高（均P＜ 0.05）；與模型組相比，電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組球囊體積/壓力明顯升高（P＜ 0.05），但AWR 評分無顯著改善（P＞ 0.05）。當(dāng)壓力為60、80 mmHg 時(shí)，與空白組相比，模型組大鼠球囊體積/壓力顯著降低（P＜ 0.05）、AWR評分顯著升高（P＜ 0.05）；與模型組相比，電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠球囊體積/壓力、AWR 評分均有顯著改善（P＜ 0.05）。見表2、3。

表2 不同胃球囊壓力下各組大鼠胃球囊體積/壓力比值評分比較Tab.2 Comparison of gastric balloon volume/pressure ratio scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，mL/mmHg

表2 不同胃球囊壓力下各組大鼠胃球囊體積/壓力比值評分比較Tab.2 Comparison of gastric balloon volume/pressure ratio scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，mL/mmHg

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05

組別空白組模型組電針組抑制劑組電針+抑制劑組F值P值80 mmHg 0.27 ± 0.01 0.18 ± 0.01*0.22 ± 0.01#0.21 ± 0.02#0.23 ± 0.01#32.84＜ 0.001例數(shù)6 6 6 6 6 20 mmHg 0.16 ± 0.01 0.14 ± 0.02 0.15 ± 0.01 0.15 ± 0.02 0.15 ± 0.01 1.294 0.2993 40 mmHg 0.20 ± 0.02 0.17 ± 0.01*0.19 ± 0.01#0.19 ± 0.01#0.19 ± 0.01#6.209＜ 0.01 60 mmHg 0.25 ± 0.02 0.19 ± 0.01*0.23 ± 0.02#0.22 ± 0.01#0.23 ± 0.01#14.08＜ 0.001

表3 不同胃球囊壓力下各組大鼠胃AWR 評分比較Tab.3 Comparison of gastric AWR scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，分

表3 不同胃球囊壓力下各組大鼠胃AWR 評分比較Tab.3 Comparison of gastric AWR scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，分

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05

組別空白組模型組電針組抑制劑組電針+抑制劑組F值P值80 mmHg 2.67 ± 0.47 3.83 ± 0.37*3.16 ± 0.37#3.16 ± 0.37#3.00 ± 0.58#4.643＜ 0.01例數(shù)6 6 6 6 6 20 mmHg 0.33 ± 0.47 0.67 ± 0.47 0.5 ± 0.5 0.67 ± 0.47 0.83 ± 0.37 0.86 0.50 40 mmHg 1.33 ± 0.47 2.83 ± 0.69*2.33 ± 0.47 2.67 ± 0.75 2.17 ± 0.69 4.383＜ 0.01 60 mmHg 2.00 ± 0.82 3.50 ± 0.50*2.50 ± 0.50#2.67 ± 0.47#2.33 ± 0.47#12.92＜ 0.001

2.3 胃組織HE 染色情況比較肉眼觀察各組大鼠胃組織黏膜皺襞清晰，未見出血、潰瘍、腫脹等器質(zhì)性病變。光鏡下各組大鼠胃黏膜層、黏膜下層與肌層分界尚清晰，結(jié)構(gòu)完整。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜HE 染色觀察Fig.1 HE staining of gastric mucosa of rats in each group

2.4 肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)、脫顆粒率與空白組相比，模型組大鼠胃肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒率顯著增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，電針組、抑制劑組和電針+抑制劑組胃肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒率明顯減少（P＜ 0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠胃肥大細(xì)胞甲胺藍(lán)染色情況Fig.2 Methylamine blue staining of gastric mast cell of rats in each group

表4 各組大鼠胃肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)和脫顆粒率比較Tab.4 Comparison of gastric mast cell count and degranulation of rats in each group ±s

表4 各組大鼠胃肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)和脫顆粒率比較Tab.4 Comparison of gastric mast cell count and degranulation of rats in each group ±s

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05

組別空白組模型組電針組抑制劑組電針+抑制劑組F值P值肥大細(xì)胞脫顆粒率（%）16.67 ± 13.05 67.64 ± 15.11*31.84 ± 16.21#38.73 ± 11.00#25.97 ± 14.50#9.449＜ 0.001例數(shù)6 6 6 6 6肥大細(xì)胞記數(shù)（個(gè)）4.83 ± 2.67 16.50 ± 3.99*9.00 ± 4.00#10.50 ± 4.37#7.83 ± 4.37#6.094＜ 0.01

2.5 胃TRPV1 免疫組化染色情況與空白組比較，模型組胃黏膜層固有層可見TRPV1 強(qiáng)陽性表達(dá)，經(jīng)軟件分析平均光密度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組TRPV1 陽性表達(dá)程度明顯降低（P＜ 0.05）。電針+抑制劑組相比于電針組、抑制劑組陽性表達(dá)顯著減少（P＜ 0.05）。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠胃黏膜TRPV1 免疫組化染色情況Fig.3 Immunohistochemical staining of TRPV1 in gastric mucosa of rats in each group

表5 各組大鼠TRPV1 免疫組化平均光密度值比較Tab.5 Comparison of average optical density values of TRPV1 immunohistochemistry in each group of rats ±s

表5 各組大鼠TRPV1 免疫組化平均光密度值比較Tab.5 Comparison of average optical density values of TRPV1 immunohistochemistry in each group of rats ±s

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05；與電針+抑制劑組比較，△P ＜ 0.05

TRPV1平均光密度值0.013 ± 0.001 0.063 ± 0.008*0.037 ± 0.005#△0.039 ± 0.005#△0.025 ± 0.004#64.71＜ 0.001組別空白組模型組電針組抑制劑組電針+抑制劑組F值P值例數(shù)6 6 6 6 6

2.6 胃NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表達(dá)和CGRP含量比較與空白組比較，模型組大鼠胃組織NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表達(dá)和CGRP 含量明顯上調(diào)（P＜ 0.05）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表達(dá)和CGRP 含量顯著下降（P＜ 0.05）；電針+抑制劑組相比于電針組、抑制劑組蛋白表達(dá)和CGRP 含量減少（P＜ 0.05）。見圖4、表6、7。

圖4 各組大鼠胃NGF/TrKA/TRPV1 蛋白印記圖Fig.4 Western blot of NGF/TrKA/TRPV1 protein in the stomach of rats in each group

表6 各組大鼠胃NGF、TrKA、TRPV1 相對蛋白表達(dá)量比較Tab.6 Comparison of relative protein expression levels of NGF， TrKA， and TRPV1 in the stomach of rats in each group ±s

表6 各組大鼠胃NGF、TrKA、TRPV1 相對蛋白表達(dá)量比較Tab.6 Comparison of relative protein expression levels of NGF， TrKA， and TRPV1 in the stomach of rats in each group ±s

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05；與電針+抑制劑組比較，△P ＜ 0.05

TRPV1 0.36 ± 0.03 1.20 ± 0.03*0.57 ± 0.03#△0.59 ± 0.02#△0.49 ± 0.02#826.0＜ 0.001組別空白組模型組電針組抑制劑組電針+抑制劑組F值P值例數(shù)6 6 6 6 6 NGF 0.62 ± 0.05 0.91 ± 0.02*0.74 ± 0.05#△0.76 ± 0.04#△0.66 ± 0.04#38.3＜ 0.001 TrKA 0.40 ± 0.03 1.19 ± 0.03*0.57 ± 0.03#△0.60 ± 0.02#△0.49 ± 0.02#742.9＜ 0.001

表7 各組大鼠胃CGRP 含量比較Tab.7 Comparison of CGRP content in the stomach of rats in each group ±s

表7 各組大鼠胃CGRP 含量比較Tab.7 Comparison of CGRP content in the stomach of rats in each group ±s

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05；與電針+抑制劑組比較，△P ＜ 0.05

CGRP含量（pg/mg）1.30 ± 0.04 2.04 ± 0.16*1.73 ± 0.09#△1.79 ± 0.10#△1.57 ± 0.08#36.32＜ 0.001組別空白組模型組電針組抑制劑組電針+抑制劑組F值P值例數(shù)6 6 6 6 6

3 討論

胃敏感性增高和胃順應(yīng)性降低是FD 的重要病理因素，與上腹痛、餐后飽脹等癥狀密切相關(guān)［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胃內(nèi)球囊壓力達(dá)40、60、80 mmHg 時(shí)，模型大鼠存在顯著胃敏感性增高和順應(yīng)性降低，表明模型建立成功［12，17］。經(jīng)電針治療后，可顯著提高40、60、80 mmHg 球囊壓力下FD大鼠胃球囊體積/壓力比值，改善60、80 mmHg 球囊壓力下FD大鼠AWR評分，且療效與使用NGF抑制劑相當(dāng)。說明電針很可能通過抑制NGF 表達(dá)發(fā)揮作用，電針可顯著改善FD 大鼠胃內(nèi)高敏感性。

活化的肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺、類胰蛋白酶和NGF 等介質(zhì)，增加TRPV1 表達(dá)，增強(qiáng)疼痛信號的傳導(dǎo)，使胃腸敏感性升高［18-19］。WONG 等［11］發(fā)現(xiàn)電針可以改善結(jié)腸炎模型大鼠直腸肥大細(xì)胞活化率。本研究證實(shí)了電針對FD 大鼠中胃黏膜肥大細(xì)胞的抑制作用。此外，本研究率先觀察到電針組、抑制劑組、抑制劑+電針對肥大細(xì)胞活化程度具有相同的下調(diào)效果，筆者猜測這可能與NGF同時(shí)是一種肥大細(xì)胞觸發(fā)劑有關(guān)［19］。

NGF 當(dāng)與高親和力受體TrKA 結(jié)合后，可激活下游信號通路，引起TRPV1 敏化［22］。TRPV1 作為一種非選擇性陽離子通道，廣泛分布于傷害性感覺神經(jīng)纖維中［23］。TRPV1 被激活后，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，進(jìn)而產(chǎn)生動(dòng)作電位，誘導(dǎo)神經(jīng)肽釋放如CGRP，從而引起內(nèi)臟高敏感性。前期有研究發(fā)現(xiàn)電針對FD 大鼠胃TRPV1 具有下調(diào)作用，但電針是否通過TRPV1 上游關(guān)鍵通路NGF/TrKA 對其產(chǎn)生調(diào)控，尚無研究證實(shí)。為此，本研究設(shè)計(jì)了NGF 抑制劑組和電針+NGF 抑制劑組。本研究發(fā)現(xiàn)FD 大鼠胃NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表達(dá)顯著上升，下游分子CGRP 含量明顯升高，電針治療具有顯著下調(diào)作用，且效果與使用NGF 抑制劑一致，但不及電針+抑制劑組。免疫組化呈現(xiàn)了相同趨勢的結(jié)果，進(jìn)一步提示了電針對主要表達(dá)于胃黏膜固有層TRPV1 具有下調(diào)作用。推測電針通過抑制NGF/TrKA/TRPV1 通路的表達(dá)，降低下游CGRP 的釋放，且電針與NGF 抑制劑對該抑制該通路存在協(xié)同作用?；贜GF/TrKA/TRPV1 在胃腸高敏感性性中的重要作用，本研究首次發(fā)現(xiàn)了電針對該通路在FD 大鼠胃組織中的下調(diào)效應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)電針可以改善FD 大鼠胃高敏感性，其機(jī)制可能與減少胃肥大細(xì)胞數(shù)量和脫顆粒率，減少NGF/TrKA/TRPV1 通路效應(yīng)分子表達(dá)，抑制CGRP 釋放有關(guān)。

【Author contributions】JIN Shuwen performed the experiments and wrote the article. LIU Jiabao， FAN Jianchao and HAN Yongli performed the experiments. LIU Wei and ZHOU Li revised the article. ZHANG Hongxing and XU Paidi designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.