新疆維吾爾自治區(qū)婦女宮頸感染人乳頭瘤病毒16型E4和L2的遺傳變異分析

程豪政,妥 靜,董楊柳,王 樂(lè),者湘漪,李洪濤,李冬妹,潘澤民

宮頸癌(cervical cancer,CC)是婦女惡性腫瘤死亡的第四大因素[1]。據(jù)報(bào)道[2],中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)宮頸癌發(fā)病率與病死率很高,該地區(qū)人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus, HPV)陽(yáng)性率為14.02%,其中多為HPV52、HPV53、HPV16和HPV18。

研究[3]表明,感染HPV16具有更強(qiáng)的致病性和致癌性。HPV16分為A譜系、B譜系、C譜系和D譜系4種變異譜系[4],中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)女性感染HPV16以歐洲病毒株為主[5]。HPV16 E4基因產(chǎn)物E4蛋白質(zhì),是HPV表達(dá)量最高的蛋白質(zhì),其氨基酸主要來(lái)源于E4開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF),且E4 ORF包含在E2 ORF內(nèi)[6-7]。E4蛋白質(zhì)可增強(qiáng)病毒復(fù)制和病毒粒子的排出[8-10]。HPV衣殼蛋白質(zhì)在病毒進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[11-12]。L2促進(jìn)了病毒基因組的逆行運(yùn)輸,促進(jìn)細(xì)胞間期將病毒基因組整合到宿主基因[13-14]。新疆維吾爾自治區(qū)HPV16 E4和L2基因的變異及分布特征尚不清楚,因此,研究HPV16 E4 和L2基因變異,有助于發(fā)現(xiàn)HPV16基因變異位點(diǎn)與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集在伊犁州友誼醫(yī)院、喀什地區(qū)人民醫(yī)院和石河子大學(xué)附屬醫(yī)院共收集了80例患者的HPV16感染陽(yáng)性的宮頸細(xì)胞樣本(脫落細(xì)胞40例,組織細(xì)胞40例);樣本收集取得了所有患者的知情同意。所有患者都無(wú)外地的長(zhǎng)期旅居史,收集樣本存放于-80 ℃低溫冰箱。

1.2 樣本的DNA提取與PCR擴(kuò)增DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司)提取DNA,DNA儲(chǔ)存在 -20 ℃的冰箱?；旌戏磻?yīng)液(40 μl)包括2×Taq PCR SuperMix 20 μl,引物各1 μl及2 μl樣本DNA。反應(yīng)程序溫度控制為94 ℃,持續(xù)5 min;34個(gè)循環(huán)×(94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min);72 ℃ 5 min。存放于-20 ℃冰箱。引物的信息,見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.3 測(cè)序上海天昊遺傳分析中心對(duì)40例脫落細(xì)胞DNA樣品進(jìn)行基因測(cè)序檢測(cè),用蝦堿性磷酸酶(北京生物技術(shù)有限公司)和核酸外切酶I(北京生物科技有限公司)純化PCR產(chǎn)物。使用Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(美國(guó)ABI公司),酒精純化產(chǎn)物后,DNA分析儀(ABI3130XL)測(cè)樣品基因序列。40例組織細(xì)胞DNA樣本通過(guò)Illumina Hiseq平臺(tái),以2×150 bp雙端測(cè)序模式進(jìn)行高通量測(cè)序,獲得FastQ數(shù)據(jù)。

1.4 HPV16變異株進(jìn)化分析分析單核苷酸多態(tài)性(Polyphred軟件),與歐洲原型病毒株(GenBank:NC_001526.4)的序列比對(duì),同時(shí)與其他HPV16變異病毒株比對(duì):歐洲株A1-A3:A1(HQ644283.1,HQ644268.1,HQ644280.1,HQ644282.1),A2:(AF536179.1),A3:(HQ644236.1);亞洲株A4[HQ644235.1(A4),HQ644248.1,AF534061.1,HQ644251.1];非洲株AF:B(HQ644238.1,HQ644240.1,HQ644290.1,HQ644298.1);C(AF472509.1,HQ644239.1,HQ644249.1,HQ 644237.1);北美NA:D1(HQ644257.1);亞美型AA:D2(HQ644263.1, HQ644277.1,HQ644279.1,HQ644281.1);D3(HQ644247.1,HQ644255.1,HQ644253.1,AF 402678.1)。MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理直接計(jì)數(shù)HPV16 E4、L2基因變異位點(diǎn)的變異頻數(shù),SPSS 26.0軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果,使用χ2檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法,分析HPV16 E4、L2單核苷酸變異與宮頸癌的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E4、L2基因的變異分析HPV16 E4和L2基因變異結(jié)果:80例DNA樣本基因測(cè)序結(jié)果,其多態(tài)性位點(diǎn)見(jiàn)表2、3。

表2 HPV16 E4 基因變異與氨基酸的改變

在80例HPV16陽(yáng)性樣本中,72例樣本存在HPV16 E4基因變異,10個(gè)位點(diǎn)存在核苷酸變異,包括4種錯(cuò)義變異和7種同義變異,其中錯(cuò)義變異分別為:A2541C(1/72,1.39%)、G2621C(1/72,1.39%)、A2636C(3/72,4.17%)和T2703G(1/72,1.39%)。氨基酸改變分別為:蘇氨酸替換為脯氨酸(T25P)、谷氨酰胺替換為組氨酸(Q51H)、谷氨酸替換為天冬氨酸(E56D)、亮氨酸替換為纈氨酸(L79V)。常見(jiàn)同義變異為nt2520(T-C)(28/72,38.89%)、nt2546(C-T/A)(70/72,97.22%;1/72,1.39%)、nt2585(G-A)(25/72,34.72%)、nt2660(T-C)(28/72,38.89%)。

在80例HPV16陽(yáng)性樣本中,74例樣本存在HPV16 L2變異,40個(gè)位點(diǎn)存在核苷酸變異,包括23種錯(cuò)義變異和18種同義變異。如表3所顯示,HPV16 L2最常見(jiàn)的錯(cuò)義變異核苷酸變異位點(diǎn)為:T4177C、A4362C、A4362T和A4654C,其氨基酸變化為絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?S269P)、亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼?L330F)和異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?I428L)。17種同義變異中變異頻率較高的位點(diǎn)為:nt4074(G-A)(73/74,98.65%)和nt4602(A-G)(15/74,20.27%),G4074A普遍存在于變異樣本中。

表3 HPV16 L2基因變異和氨基酸改變

表4 病例組與對(duì)照組中HPV16 E4的基因變異

表5 病例組與對(duì)照組中 HPV16 L2 基因組的基因變化

2.2 HPV16 E4和L2核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用N-J法,Bootstrap method(1000 replication)和Kimura 2-parameter model構(gòu)建HPV16 E4、L2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),只顯示大于50%的Bootstrap值,其中Bootstrap值>70%提示可靠性很好,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。通過(guò)HPV16 E4、L2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)有76個(gè)樣本為歐洲變體,4個(gè)樣本為亞洲變體。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非洲變體、美洲變體和亞美變體。亞洲變體X18、X20、Z91和CN-148中的變異都與 G4181A變異相關(guān)。

圖1 HPV16病毒E4和L2基因進(jìn)化分析及病毒株統(tǒng)計(jì)

2.3 病例組與對(duì)照組中HPV16 E4、L2的基因變異

2.3.1病例組和對(duì)照組中HPV16 E4基因組的基因變異 如表4所示,通過(guò)對(duì)病例組(宮頸癌組)與對(duì)照組(非宮頸癌組)中E4基因變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)對(duì)照組有1種錯(cuò)義變異,病例組有3種錯(cuò)義變異,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,這些錯(cuò)義變異在對(duì)照組與病例組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

2.3.2病例組與對(duì)照組基因組HPV16 L2的遺傳變異 如表5顯示的對(duì)照組和病例組中L2基因的錯(cuò)義變異分布。對(duì)照組有17種錯(cuò)義變異,病例組有14種錯(cuò)義變異,其中錯(cuò)義變異T4177C(P=0.012),A4288C(P=0.04)和A4654C(P=0.026)在病例組變異頻率明顯高于對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),氨基酸變化分別為絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?S269P)、異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?I306L)和異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?I428L)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的錯(cuò)義變異位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果,見(jiàn)圖2。

圖2 HPV16 L2基因錯(cuò)義變異具有顯著差異位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

3 討論

HPV基因變異的研究大多聚焦在病毒E6和E7基因上,而E6和E7的變異會(huì)對(duì)宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展產(chǎn)生影響。HPV16 E4基因變異和缺失會(huì)影響病毒粒子在細(xì)胞間的傳播,L2基因的變異和缺失會(huì)導(dǎo)致病毒基因組整合到細(xì)胞核染色體過(guò)程的改變[8-13]。

通過(guò)HPV16 E4、L2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,有76個(gè)樣本為歐洲變異株,4個(gè)樣本為亞洲變異株。這與已有報(bào)道[15]的新疆維吾爾自治區(qū)主要流行株為歐洲株,少數(shù)為亞洲株的情況類(lèi)似,然而4例亞洲變異株均與L2基因錯(cuò)義變異G4181A有關(guān),這一發(fā)現(xiàn)尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。在HPV16 E4上常見(jiàn)的錯(cuò)義變異位點(diǎn)發(fā)生頻率并不高,且HPV16 E4基因位于E2基因的中心位置,該區(qū)域編碼E2蛋白質(zhì)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域[6-7]。E4基因最常見(jiàn)的同義變異C2546T(97.22%)和G2585A(34.72%)在HPV16 E2基因的表達(dá)中為錯(cuò)義變異,且位于E2基因鉸鏈區(qū)間接導(dǎo)致E2蛋白質(zhì)的氨基酸改變,最終導(dǎo)致E6、E7表達(dá)的變化,表2顯示的 E4基因變異G2504A、T2520C、C2546T、G2585A、T2660C和T2703G與已有的關(guān)于E4的報(bào)道結(jié)果一致[16],而錯(cuò)義變異A2541C、G2621C、A2636C和同義變異T2672G尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

在HPV16 L2基因上常見(jiàn)的錯(cuò)義變異位點(diǎn)分別為T(mén)4177C、A4362C/T和A4654C,其氨基酸變化分別為S249P、L330F和I428L,且同義變異G4074A普遍存在于樣本中。研究表明L2基因的錯(cuò)義變異T4177C、A4288C和A4654C在病例組中高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L2蛋白質(zhì)對(duì)病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核有促進(jìn)作用,可以表明該變異可能會(huì)促進(jìn)病毒基因組的感染和整合,這仍需要深入研究給予證明。由于HPV16 E4和L2在病毒感染和傳播方面的作用,E4基因的改變會(huì)間接影響E2基因的變化,最終導(dǎo)致E6和E7表達(dá)的改變,因此,可以通過(guò)E4基因的變異間接了解病毒的復(fù)制及傳播能力。此外,還可以結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究HPV16 L2基因 T4177C、A4288C和A4654C的變異對(duì)病毒基因組侵入細(xì)胞與整合到細(xì)胞基因組的作用。

綜上所述,新疆維吾爾自治區(qū)主要流行病毒株為歐洲株,少數(shù)為亞洲株;HPV16 L2基因中T4177C、A4288C、A4654C在宮頸癌中的變異頻率高于非宮頸癌,且G4181A與亞洲株相關(guān)。