槲皮素激活焦亡途徑抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究*

榮耀 劉松華 唐明政 蔡輝

據(jù)最近數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌在全球癌癥死亡率中居第4 位，已成為全球重要的公共衛(wèi)生安全問題[1]。胃癌是一種表型高度異質(zhì)化的疾病，其發(fā)展機(jī)制復(fù)雜[2]。在胃癌發(fā)展的多階段級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中，由幽門螺旋桿菌誘發(fā)的炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥是主要的病理改變過程[3]。此外，胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種生物過程，包括原癌和抑癌基因的突變或失活、DNA 損傷、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生等[4-6]。目前，化療和放療是中晚期胃癌的主要治療手段，但在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性和轉(zhuǎn)移往往意味著治療的失敗。因此，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上探索有效的干預(yù)措施及其機(jī)制具有重要意義。

中草藥因其多靶點(diǎn)作用、低不良反應(yīng)和增強(qiáng)化療效果而被廣泛應(yīng)用。槲皮素是一種天然的中藥單體成分，具有抗炎抗氧化等多種生物作用[7]。槲皮素還能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制腫瘤相關(guān)血管生成、促進(jìn)凋亡和自噬等方式發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。據(jù)報(bào)道，槲皮素通過調(diào)節(jié)Akt-mTOR/HIF-1α 信號(hào)通路以激活自噬和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗胃癌作用[9]。然而，槲皮素的抗胃癌作用機(jī)制還需要進(jìn)一步揭示。既往研究表明，除了細(xì)胞凋亡和自噬外，槲皮素還能通過介導(dǎo)鐵死亡、壞死性凋亡等多種程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）形式來發(fā)揮抗癌作用[7]，但尚缺乏槲皮素與胃癌中焦亡途徑聯(lián)系的相關(guān)報(bào)道。焦亡是一種依賴于激活半胱天冬酶家族的促炎性細(xì)胞死亡形式，其在抑制腫瘤發(fā)展和癌癥治療方面起著重要作用[10]。焦亡的發(fā)生主要包括半胱天冬酶1（cleaved caspase-1，CASP1）依賴的經(jīng)典途徑和caspase-4/5/11 依賴的非經(jīng)典途徑[11]。近年來，一種新的焦亡信號(hào)通路半胱天冬酶3（CASP3）/加斯德明E（gasdermin E，GSDME）出現(xiàn)在該研究領(lǐng)域，豐富了基于焦亡的疾病治療的相關(guān)研究方向[12]?；诖?，本研究旨在探討槲皮素對(duì)胃癌細(xì)胞焦亡途徑的調(diào)控及抗胃癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

AGS 胃癌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源中心。槲皮素購(gòu)自北京索萊寶公司。RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清等試劑購(gòu)自上海龍?zhí)锷锟萍加邢薰?。?xì)胞培養(yǎng)瓶等耗材均購(gòu)自無錫耐思生命科技股份有限公司。CCK-8 試劑盒購(gòu)自美國(guó)APExBIO 公司。Western blot 所需試劑和設(shè)備購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司和美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將AGS 胃癌細(xì)胞置于37℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中，用含10%FBS、1%雙抗（鏈霉素和青霉素）的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。槲皮素組用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，并將其配置成20、40、60、80、100 μmol/L 的終濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖與IC50值 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1.5×104個(gè)/mL。在96 孔板中設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按不同濃度的槲皮素處理細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h 時(shí)移除孔板中的培養(yǎng)液，按照CCK-8 試劑說明書操作并檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度值。計(jì)算不同時(shí)點(diǎn)各組胃癌細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）］×100%，抑制率=［（對(duì)照孔-實(shí)驗(yàn)孔）/（對(duì)照孔-空白孔）］×100%。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移能力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，以每孔60×104個(gè)的細(xì)胞數(shù)量接種于六孔板中，培養(yǎng)至匯合度接近100% 時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。PBS 清洗后用10 μL 槍頭進(jìn)行劃線操作。各孔依次加入0、20、40、60、80 和100 μmol/L 濃度的槲皮素?zé)o血清藥物培養(yǎng)基，分別在0、12、24 和48 h 觀察細(xì)胞遷移情況并攝像保存，測(cè)量愈合度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。遷移率計(jì)算方法：0 h 的劃痕寬度值為A，愈合后寬度設(shè)為B，遷移率=（A-B）/A×100%。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染AGS 細(xì)胞株 培養(yǎng)AGS 細(xì)胞至密度達(dá)到70%～90%后進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前1 天，采用無血清培養(yǎng)基代替完全培養(yǎng)基。根據(jù)云舟生物公司提供的轉(zhuǎn)染用慢病毒載體使用說明書，用Lipofectamine-2000 轉(zhuǎn)染試劑盒將載體shRNA-NC、shRNA-CASP3分別轉(zhuǎn)染到AGS 細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染4～6 h 后，換成新鮮完全培養(yǎng)基，處理72 h 后提取蛋白，進(jìn)一步檢測(cè)CASP3 的敲減效果。shRNA-3294 靶序列：ATGCCGACAAGCTTGAATTTA；shRNA-3297 靶序列：TCCACAGCACCTGGTTATTAT；shRNA-3203 靶序列：ATCCCTGGACAACAGTTATAA。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 根據(jù)M5 Universal RNA Mini Kit 說明書提取RNA，檢測(cè)光密度D（260/280 nm）值以確定RNA 的濃度和純度達(dá)標(biāo)。根據(jù)M5 Sprint qRT-PCR 試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒（去除gDNA）的說明，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（含TliRNaseH）被用作qRT-PCR 檢測(cè)的熒光染料。CASP3 mRNA 引物及內(nèi)參GAPDH mRNA 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)和合成，CASP3 所用序列為正向：5’-GTGGGACTGATGAGGAGATGGC-3'，反向：5'-AAGGGACTGGATGAACCACGAC-3'；GAPDH 所用序列為正向：5’-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。CASP3 的mRNA 表達(dá)水平通過2-ΔΔCt法計(jì)算和分析。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot） 胃癌細(xì)胞系的培養(yǎng)密度約為80%，PBS 緩沖液清洗后用添加苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的高效裂解液（RIPA 裂解液）完全裂解細(xì)胞，離心（12 000 rpm，4℃，10 min）并收集上清液。使用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)蛋白質(zhì)樣品取20 μg，用SDS-PAGE 分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。隨后用無蛋白快速封閉液封閉膜，TBST 漂洗液漂洗3 遍，每次5 min。將膜與目的蛋白（cleaved CASP1、CASP3、GSDMD）、GSDME、NLR 家族Pyrin 域包含3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）、聚（ADP-核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］及內(nèi)參［GAPDH 和β 微管蛋白（β-tubulin）］的一抗在4℃搖床上孵育過夜。TBST 漂洗液漂洗后與二抗孵育1 h，再用TBST 漂洗液沖洗3 次，每次10 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒使印跡可視化。使用Image J軟件分析蛋白條帶的總灰度值，以量化基因的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.5.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抑制AGS 人胃癌細(xì)胞的增殖能力

AGS 胃癌細(xì)胞經(jīng)20、40、60、80、100 μmol/L 濃度的槲皮素處理24 h 和48 h。CCK-8 檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，隨著實(shí)驗(yàn)組中槲皮素濃度的提升，AGS 細(xì)胞的活力下降，其增殖能力被顯著抑制（圖1A，C）。此外，用槲皮素處理AGS 細(xì)胞24 h 的IC50值為50.47 μmol/L，48 h 的IC50值為35.09 μmol/L（圖1B，D）。

圖1 槲皮素對(duì)AGS 細(xì)胞增殖的影響及IC50 值

2.2 槲皮素抑制AGS 人胃癌細(xì)胞的遷移能力

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槲皮素影響AGS 細(xì)胞的遷移能力。如圖2A、B 所示，槲皮素干預(yù)實(shí)驗(yàn)組12、24、48 h 后，AGS 細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組（0 μmol/L）明顯下調(diào)，且降低程度隨槲皮素濃度的升高而改變。

燃燒法是將有機(jī)氣體燃燒氧化成CO2和H2O等從而凈化廢氣，可分為直接燃燒法、熱力燃燒法、催化燃燒法、蓄熱燃燒法等類型[5]。

圖2 各濃度槲皮素對(duì)AGS 細(xì)胞遷移的影響

2.3 槲皮素干預(yù)AGS 人胃癌細(xì)胞后焦亡與凋亡標(biāo)志物的表達(dá)變化

經(jīng)20、40、80 μmol/L 濃度的槲皮素藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS 細(xì)胞48 h 后，提取總蛋白并通過Western blot 檢測(cè)cleaved CASP1、CASP3、GSDMD、GSDME、NLRP3、PARP 蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明，經(jīng)槲皮素干預(yù)后的AGS 細(xì)胞中cleaved CASP1、GSDMD、GSDME 的表達(dá)隨槲皮素濃度增加而上調(diào)。NLRP3在80 μmol/L 濃度的條件下表達(dá)上調(diào)。CAPS3 的表達(dá)增強(qiáng)，PARP 的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)（圖3A～C）。

圖3 各濃度槲皮素干預(yù)AGS 細(xì)胞后相關(guān)標(biāo)志物的蛋白印記圖

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染敲減CASP3 表達(dá)

通過qRT-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，與shRNA-NC 組相比較，轉(zhuǎn)染shRNA-3927 靶點(diǎn)的CASP3 的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著降低（轉(zhuǎn)染效率18.7%，P＜0.000 1，圖4A）。蛋白水平的檢驗(yàn)結(jié)果同樣表明（圖4B～C），轉(zhuǎn)染shRNA-3 927 靶點(diǎn)的CASP3 蛋白水平表達(dá)顯著降低（轉(zhuǎn)染效率23.4%，P＜0.000 1）。由此證明轉(zhuǎn)染成功敲低CASP3 的表達(dá)水平。

圖4 AGS（shRNA-CASP3）穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建

2.5 Western blot 檢測(cè)AGS（shCASP3）細(xì)胞系中GSDMD、GSDME、PARP 的表達(dá)

通過Western blot 檢測(cè)AGS（shCASP3）細(xì)胞系中GSDMD、GSDME、PARP 的表達(dá)變化，與正常的AGS 細(xì)胞相比，AGS（shCASP3）中GSDME 的表達(dá)顯著上調(diào)，PARP 的表達(dá)顯著下調(diào)，而GSDMD 的表達(dá)無明顯變化（圖5A，B）。

圖5 各濃度槲皮素干預(yù)AGS（shCASP3）細(xì)胞系后相應(yīng)標(biāo)志物的蛋白水平變化

2.6 經(jīng)槲皮素干預(yù)的AGS（shCASP3）細(xì)胞系中GSDMD、GSDME、PARP 的表達(dá)變化

為觀察槲皮素對(duì)AGS（shCASP3）細(xì)胞系的干預(yù)影響，用20、40、80 μmol/L 濃度的槲皮素藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS（shCASP3）細(xì)胞系48 h，提取總蛋白后進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)槲皮素干預(yù)后，AGS（shCASP3）細(xì)胞系中GSDME 的表達(dá)在20 和40 μmol/L 濃度槲皮素的干預(yù)下被下調(diào)，GSDMD 的表達(dá)被上調(diào)，PARP 在80 μmol/L 濃度的槲皮素干預(yù)后被上調(diào)（圖5C，D）。

3 討論

胃癌細(xì)胞的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者病情加劇和死亡的主要原因。目前，有關(guān)槲皮素抗胃癌治療的研究主要涉及其對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的抑制作用及對(duì)凋亡和自噬的影響[9，13]，但缺乏槲皮素介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的焦亡途徑的研究。D'Souza 等[14]在2001年首次提出“焦亡”這一概念，其區(qū)別于細(xì)胞凋亡和其他的PCD 形式。焦亡的出現(xiàn)再次豐富了腫瘤治療的前景。

焦亡是一種天然的免疫反應(yīng)，首先被發(fā)現(xiàn)在抗感染方面發(fā)揮著突出作用[15]。在存在病原體相關(guān)的分子模式或細(xì)胞衍生的損傷相關(guān)的分子模式的情況下，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌、病毒等病原體能夠被胞膜上的模式識(shí)別受體所識(shí)別，進(jìn)而激活如NLR 家族Pyrin 域包含蛋白1（NLR family pyrin domain containing 1，NLRP1）、NLRP3、NLR 家族CARD 結(jié)構(gòu)域包含蛋白4（NLR family CARD domain containing 4，NLRC4）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）等炎癥小體并最終觸發(fā)焦亡途徑[16]。有研究表述，粘蛋白1（mucin 1，MUC1）在幽門螺旋桿菌激活NLRP3 炎癥小體的過程中常產(chǎn)生保護(hù)性調(diào)控[17]，提示幽門螺旋桿菌誘發(fā)胃癌機(jī)制可能與細(xì)胞焦亡存在潛在的聯(lián)系。細(xì)胞焦亡途徑的觸發(fā)依賴于CASP1 主導(dǎo)的經(jīng)典途徑和CASP4/5/11 主導(dǎo)的非經(jīng)典途徑。CASP1 和CASP4/5/11 均通過切割執(zhí)行蛋白 GSDMD 而誘發(fā)細(xì)胞焦亡，GSDMD 裂解后隨即釋放N 端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合膜脂質(zhì)并穿孔細(xì)胞膜，這導(dǎo)致胞內(nèi)外的滲透壓水平失衡，最終引發(fā)細(xì)胞膜破裂[10,18]。體內(nèi)研究表明，腫瘤細(xì)胞觸發(fā)焦亡后能夠募集抗腫瘤免疫細(xì)胞，而免疫細(xì)胞也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡，從而建立正反饋回路[19,20]。此外也有研究表明，細(xì)胞焦亡是細(xì)胞凋亡發(fā)生后的繼發(fā)性壞死的結(jié)果，即凋亡細(xì)胞的質(zhì)膜完整性逐漸喪失的過程[12]。

一項(xiàng)通過5-氟尿嘧啶干預(yù)胃癌細(xì)胞進(jìn)而探索胃癌化療機(jī)制的研究表明，GSDME 能夠?qū)⒒熕幷T導(dǎo)下的CAPS3 主導(dǎo)的非炎性細(xì)胞凋亡過渡為焦亡途徑[23]。盡管CAPS3 主要參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行與調(diào)控過程，但其同時(shí)能夠作為上游蛋白去切割下游的GSDME，以形成GSDME-N 端結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而觸發(fā)焦亡導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和破裂[12,20]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過上調(diào)CASP3/GSDME 這一特殊途徑來激活細(xì)胞焦亡以發(fā)揮抗胃癌作用。相較于正常AGS 細(xì)胞，GSDME 在構(gòu)建的AGS（shCASP3）細(xì)胞系中表達(dá)水平上調(diào)。繼續(xù)用20、40、80 μmol/L 濃度的槲皮素來干預(yù)AGS（shCASP3）細(xì)胞系，結(jié)果顯示GSDME 在受到干預(yù)后的表達(dá)水平有所降低。這從反面驗(yàn)證了槲皮素可能與CASP3/GSDME 通路具有潛在的相關(guān)性，并可能激活焦亡來發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞功能的作用。

大多數(shù)參與焦亡途徑的蛋白酶在各自的GSDM蛋白缺失時(shí)可選擇性介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞焦亡與凋亡之間的平衡在很大程度上取決于GSDM 蛋白的表達(dá)水平。因此，本研究具有一定的局限性，還需要在多種胃癌細(xì)胞內(nèi)及體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，槲皮素可能通過激活CASP1/GSDMD、CASP3/GSDME 信號(hào)通路來發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移等作用。

本文無影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。