LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響*

李思杰 王浩源 段亞濤 劉宗航 張愛(ài)莉

膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高[1]。流行病學(xué)研究表明，吸煙和職業(yè)暴露是膀胱癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[2]。由于其具有較高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，及早期癥狀不明顯等特點(diǎn)，使早期膀胱癌患者易延誤病情，導(dǎo)致死亡率較高[3]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）通過(guò)各種機(jī)制在調(diào)節(jié)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。研究顯示，LncRNA MIR210HG 是與肺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤相關(guān)的LncRNA 分子[5]。Bu 等[6]研究表明，LncRNA MIR210HG 在非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)miRNA-874 可阻斷LncRNA MIR210HG 對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。Yu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA MIR210HG表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲性，miRNA-210b-2p 可拮抗LncRNA MIR210HG 對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)膀胱癌組織中的LncRNA MIR210HG 表達(dá)，分析其與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系，探討LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，為膀胱癌患者的臨床治療及提高其總生存率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病理資料 收集2022 年6 月至2022 年12 月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行膀胱癌手術(shù)的70 例患者的標(biāo)本，均有完整的臨床病理資料，其中男性50 例、女性20 例，年齡44～85 歲，平均年齡（66.8±10.8）歲，病理類(lèi)型均為尿路上皮癌。根據(jù)WHO 1973 年分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，病理學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)24 例、Ⅲ級(jí)46 例；非肌層浸潤(rùn)的膀胱癌42 例、肌層浸潤(rùn)的膀胱癌28 例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9 例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理診斷為膀胱癌；患者為首次確診，術(shù)前未行輔助治療；具有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)提示可疑遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；患有其他腫瘤；有嚴(yán)重心臟疾病，肝、腎功能不全；有自身免疫性疾病。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，及患者知情同意。

1.1.2 細(xì)胞及質(zhì)粒 人膀胱癌細(xì)胞株5 637 和T24均購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司，人膀胱癌細(xì)胞株SW780 和正常的膀胱上皮細(xì)胞株SV-HUC-1 均購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。LncRNA MIR210HG過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-MIR210HG 及對(duì)照的pcDNA 3.1-NC，si-MIR210HG-1、si-MIR210HG-2 及對(duì)照的si-NC 均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTPCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自瑞士Roche 公司；RT-PCR Master Mix、MTS 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；TrizolRNA 提取試劑、LB 培養(yǎng)基均購(gòu)自北京Solabio 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自中國(guó)Airtech 公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測(cè)組織與細(xì)胞中LncRNA MIR-210HG 相對(duì)表達(dá)量 使用TrizolRNA 試劑提取組織、人膀胱癌細(xì)胞株T24、5 637、SW780 及正常的膀胱上皮細(xì)胞株SV-HUC-1 中的總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以其為模板按照RT-PCR 試劑盒操作步驟擴(kuò)增引物。引物序列：LncRNA MIR210HG 上游為5′-GCAGGCACAGGTGTGGTCATATC-3′，下游為5′-AGGCAGGCTCAGCAGACAGG-3′；GAPDH 上游為5′-GAGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游為5′-G CCCAATACGACCAAATCC-3′。應(yīng)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/）檢 索LncRNA MIR-210HG 在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA MIR210HG 相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 所有細(xì)胞培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中（CO2濃度為5%）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的人膀胱癌細(xì)胞株均勻接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞密度達(dá)80% 時(shí)依照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染說(shuō)明開(kāi)展轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后提取總RNA，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為si-NC、si-MIR210HG、pcDN A3.1-NC 及pcDNA3.1-MIR210HG 組。

1.2.3 MTS 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后加入含血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至1×104/mL，取0.1 mL 接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組6 個(gè)復(fù)孔。分別在細(xì)胞貼壁后的0、24、48、72、96 h 加入0.02 mL MTS 試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD 值）。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后加入含血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至1×103/mL，取3 mL 接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)96 h。使用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染液染色、PBS 溶液反復(fù)清洗后室溫干燥。在顯微鏡下計(jì)數(shù)，如細(xì)胞數(shù)目＞50 個(gè)即可認(rèn)為為1 個(gè)克隆。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后加入含血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至2.5×105/mL，取2 mL 接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全融合后使用0.2 mL 移液器吸頭均勻劃痕。0、12 h 和24 h 倒置顯微鏡下測(cè)量劃痕間距。

1.2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋Matrigel 膠，在小室上層鋪入0.02 mL 稀釋的Matrigel 膠并去除氣泡。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后采用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至濃度為5×105/mL，取0.2 mL 加入上室，下室加入0.6 mL 含血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后取出小室，4%多聚甲醛固定并使用0.5%結(jié)晶紫染液染色，100 倍顯微鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MIR210HG 在不同組織和細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量比較

膀胱癌組織中的LncRNA MIR210HG 表達(dá)量為3.03±0.97，高于癌旁組織中的1.24±0.74（t=12.341，P＜0.001，圖1A）。T24、5 637 和SW780 膀胱癌細(xì)胞系中的LncRNA MIR210HG 表達(dá)量分別為3.513±0.798、5.837±0.420 和2.420±0.523，均高于SV-HUC-1的1.073±0.427，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖1B）。其中5 637 細(xì)胞的表達(dá)量較高，用于下調(diào)LncRNA MIR210HG 表達(dá)；SW780 細(xì)胞的表達(dá)量較低，用于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)LncRNA MIR210HG 在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)含量（圖1C）。

圖1 LncRNA MIR210HG 在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)量

2.2 膀胱癌組織中LncRNA MIR210HG 相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的相關(guān)性

LncRNA MIR210HG 相對(duì)表達(dá)量與性別、年齡、是否吸煙、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、病理分級(jí)均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與存在肌層浸潤(rùn)的膀胱癌組織中明顯升高（均P＜0.05，表1）。

表1 70 例患者的膀胱癌組織中的LncRNA MIR210HG 相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2.3.1 下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響 成功構(gòu)建下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210H 的膀胱癌細(xì)胞系，并通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率（圖2），其中si-MIR210HG-1 因下調(diào)效果更明顯選擇其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTS 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-NC 組細(xì)胞的OD 值與si-MIR210HG 組相比在72 h開(kāi)始差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；pcDNA3.1-NC 組細(xì)胞的OD 值與pcDNA3.1-MIR210HG 相比在48 h開(kāi)始差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-NC 組克隆形成數(shù)與si-MIR210HG組相比在96 h 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；pcDNA3.1-NC 組克隆形成數(shù)與pcDNA3.1-MIR210-HG 組相比在96 h 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4）。

圖2 RT-PCR 檢測(cè)下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210H 膀胱癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率

圖3 MTS 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

圖4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響

2.3.2 下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)LncRNA MIR210HG 后細(xì)胞遷移能力于24 h時(shí)下降（P＜0.05）；過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 后細(xì)胞遷移能力于24 h 時(shí)升高（P＜0.05，圖5）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)LncRNA MIR210HG 后細(xì)胞侵襲能力顯著降低（P=0.000 1）；過(guò)表達(dá)LncRNA MIR-210HG 后細(xì)胞侵襲能力顯著升高（P=0.000 1，圖6）。

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響

圖6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)與過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤高[8]，主要分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer，MIBC）。超過(guò)60% NMIBC患者會(huì)進(jìn)展為MIBC[9]。MIBC 患者雖可使用手術(shù)聯(lián)合化療、免疫治療等方法，但其預(yù)后仍不理想。因此，尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行早期診斷，抑制其侵襲性和轉(zhuǎn)移性，可提高膀胱癌患者的生存率并改善預(yù)后。

LncRNA MIR210HG 在多種癌癥中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Li 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-210 和LncRNA MIR-210HG 可協(xié)同促進(jìn)胃癌的遷移和轉(zhuǎn)移，通過(guò)沉默原癌基因c-Myc 抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展。Shi 等[11]研究表明，乳腺癌中LncRNA MIR210HG 高表達(dá)，IGF2BP1 誘導(dǎo)LncRNA MIR210HG 表達(dá)并促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIR210HG 在膀胱癌組織中高表達(dá)，并在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肌層浸潤(rùn)的膀胱癌組織中表達(dá)進(jìn)一步升高；檢測(cè)LncRNA MIR210HG 在膀胱癌細(xì)胞系（T24、5637、SW780）中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIR210HG 在膀胱癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量較高。本研究表明，下調(diào)LncRNA MIR210HG 表達(dá)降低了5637 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力；過(guò)表達(dá)LncRNA MIR210HG 可促進(jìn)SW780 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。

研究表明，檢測(cè)血液標(biāo)本中作為生物標(biāo)志物的LncRNA 有助于膀胱癌患者的診斷、預(yù)后及治療[12]。其中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（TRAF4）已被證實(shí)是多種癌癥的腫瘤啟動(dòng)子，在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)[13]；過(guò)表達(dá)miRNA-503-5p 可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[14]；TRAF4 被證實(shí)是miRNA-503-5p 的靶基因，LncRNA MIR210HG 通過(guò)作用于miRNA-503-5p 調(diào)節(jié)TRAF4的表達(dá)[15]。以上研究提示，LncRNA MIR210HG 可能通過(guò)作用于miRNA-503-5p/TRAF4 軸促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

總之，膀胱癌組織中的LncRNA MIR210HG 明顯高表達(dá)，促進(jìn)了膀胱癌肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并參與膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。本研究提示，在膀胱癌中LncRNA MIR210HG 促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，可為膀胱癌患者的臨床治療及提高其總生存率提供參考依據(jù)。

本文無(wú)影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。