基于SSR分子標(biāo)記的154份桃品種遺傳多樣性分析

殷紀(jì)偉 韓貝貝 馬瑩雪 武星廷 徐振江 姜建福 陳昌文 韓瑞璽

摘要：利用簡單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記對桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，構(gòu)建桃品種的分子數(shù)據(jù)庫，為桃品種的鑒定提供技術(shù)依據(jù)。利用10個(gè)SSR標(biāo)記對154份桃品種進(jìn)行指紋采集，通過聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析研究其遺傳多樣性。結(jié)果表明，10對SSR引物共檢測出140個(gè)等位變異，變異范圍為8～27；共獲得304個(gè)基因型，變化范圍為17～59；引物多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍為0.510 9～0.824 2，申請品種保護(hù)和登記的品種遺傳多樣性較已知品種低。根據(jù)Neis遺傳距離進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析，供試品種可劃分為5個(gè)大類，各品種間的遺傳距離在0.029 3～1.000 0之間，其中2對品種未區(qū)分開。對供試品種進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)可以劃分為4個(gè)亞群，大部分材料的親緣關(guān)系比較單一。方差分析結(jié)果表明，10%的遺傳變異來自群體間，72%的遺傳變異來自群體內(nèi)部，群體內(nèi)的變異大于群體間。154份桃品種的遺傳多樣性水平適中，群體間的遺傳分化程度處于中等水平，同一育種單位的品種遺傳距離較近。研究結(jié)果可為不同類型桃育種創(chuàng)新、分子指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及品種鑒定提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桃；SSR；遺傳多樣性；群體結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S662.102文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0018-08

收稿日期：2022-10-11

基金項(xiàng)目：物種品種資源保護(hù)項(xiàng)目（編號：h20210472）；農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)（編號：2130109）。

作者簡介：殷紀(jì)偉（1998—），男，安徽宣城人，碩士研究生，從事分子生物學(xué)研究。E-mail：jiwyin@163.com。

通信作者：韓瑞璽，博士，高級農(nóng)藝師，主要研究方向?yàn)橹参镄缕贩N保護(hù)和DNA分子技術(shù)應(yīng)用。E-mail：wudifeixue007@163.com。

桃（Prunus persica L.）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）的一種重要落葉果樹，是全球第三大重要的溫帶水果^［1］。中國擁有世界上最長的桃栽培歷史^［2］，種質(zhì)資源比較豐富，其種植面積、產(chǎn)量均居世界首位^［3］。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對桃進(jìn)行品種鑒定及種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，對我國桃種質(zhì)資源利用和育種創(chuàng)新具有重大意義。隨著基因組學(xué)的不斷發(fā)展，基于DNA的遺傳標(biāo)記在植物分子研究中被廣泛應(yīng)用，簡單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記技術(shù)由于具有可重復(fù)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋分析和遺傳多樣性分析方面有重要的應(yīng)用價(jià)值^［4］。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被用于鑒定葡萄^［5］、柑橘^［6］、蘋果^［7］、獼猴桃^［8］、櫻桃^［9］等果樹品種或種質(zhì)資源。近年來SSR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)研究中，如品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究等。Cheng等利用7對SSR引物構(gòu)建了32個(gè)桃地方品種的指紋圖譜，并評估了品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系^［10］；葛志剛等利用SSR標(biāo)記對22個(gè)蟠桃品種及另外9種類型桃品種的遺傳多樣性的分析結(jié)果顯示，蟠桃的遺傳多樣性較高^［11］；Xie等采用34個(gè)SSR標(biāo)記分析了浙江地區(qū)的94份桃種質(zhì)資源的多樣性，發(fā)現(xiàn)引進(jìn)品種的種質(zhì)多樣性高于地方品種^［12］；李雄偉等利用16個(gè)SSR標(biāo)記對國內(nèi)外669份桃的遺傳多樣性進(jìn)行測試并構(gòu)建了相應(yīng)的分子指紋圖譜^［13］；凌士鵬等對不同來源的桃品種進(jìn)行SSR分析，發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果和品種的地理分布之間存在一定的相關(guān)性，相同地理來源的品種較為集中地聚在一起^［14］；根據(jù)桃果實(shí)性狀，可以將桃劃分為多個(gè)類型，魏姍姍等開發(fā)了18個(gè)SSR標(biāo)記對桃果實(shí)的形狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)扁球形桃類群的遺傳多樣性較球形豐富，對桃有無毛性狀的分析結(jié)果表明，有毛類群的遺傳多樣性和基因雜合度高于無毛類群^［15］；劉偉等以60份山東省地方桃種質(zhì)資源為研究材料，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了分子身份證，相關(guān)研究可為山東省地方桃品種資源鑒定和種質(zhì)資源利用與保護(hù)奠定基礎(chǔ)^［16］。通過對桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行評價(jià)，可為今后桃種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用提供參考依據(jù)。但是，目前對于新育成的桃品種，尚未有人分析并及時(shí)構(gòu)建DNA分子數(shù)據(jù)庫。本研究首次以近5年申請品種權(quán)保護(hù)的桃品種為材料，并且通過果實(shí)類型進(jìn)行聚類分析，前人在此方面的研究報(bào)道較少。隨著國內(nèi)桃新品種權(quán)申請量逐年增加，通過比較申請品種權(quán)保護(hù)品種和已知品種間的遺傳多樣性，不同育種單位和地區(qū)育種水平的相關(guān)研究較少。本研究構(gòu)建了154份桃品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并對申請品種保護(hù)的品種和已知品種間進(jìn)行遺傳多樣性比較分析，可為加快我國桃種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用和桃品種權(quán)保護(hù)提供參考，為桃品種鑒定和輔助桃新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試（簡稱DUS測試）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)于2022年在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心植物新品種測試中心進(jìn)行，試驗(yàn)材料包括申請新品種權(quán)保護(hù)的品種63份、登記品種13份、已知品種78份，共154份，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試中心提供，供試品種的基本信息見表1。

DNA聚合酶、PCR Buffer等購于南京諾維贊生物科技股份有限公司；甲酰胺、LIZ500購于ABI公司。主要設(shè)備儀器：Nano Drop 1000微量分光光度儀、ETC-811定性PCR儀、Applied Biosystems^TM3730基因分析儀、組織研磨儀等。

1.2 SSR引物

本研究中用于檢測的SSR引物選自《桃品種鑒定? SSR分子標(biāo)記法》中規(guī)定的10對核心引物（表2），普通引物、熒光引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)等位變異大小在熒光引物5′端添加6-羧基熒光素（FAM）、六氯熒光素（HEX）、羧基四甲基羅丹明（TAMRA）熒光基團(tuán)。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法^［17］提取新鮮葉片的基因組DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA的完整性檢測，用紫外分光光度計(jì)Nano drop1000測定DNA的質(zhì)量和濃度，并將其稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 μL，包含1 μL 50 ng/μL DNA模板、1 μL 10×PCR Buffer、各 0.3 μL 10 μmol/L上下游引物、0.1 μL Taq DNA聚合酶、2.5 mmol/L dNTP，加 6.5 μL ddH₂O補(bǔ)足至10 μL。PCR 擴(kuò)增參考《桃品種鑒定? SSR分子標(biāo)記法》中的擴(kuò)增程序，具體如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；4 ℃保存20 min。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測

分別吸取1.2 μL不同熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻后加超純水稀釋100倍，從稀釋混合液中分別吸取1 μL加入96孔板中。每孔另外加入8.9 μL去離子甲酰胺、0.1 μL ABI GeneScan 500LIZ分子量內(nèi)標(biāo)，離心30 s后于94 ℃變性5 min，冷卻后上機(jī)檢測，具體操作步驟和流程參考儀器操作說明。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

用SSR Analyser （V1.2.6，http：//172.16.2.68：8080/ssr3/no/index）對電泳的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。用Powermarker V3.25計(jì)算不同品種間的遺傳距離，并構(gòu)建基于Neis遺傳距離的非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類圖。利用Ntsys 2.11進(jìn)行遺傳相似度分析，用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，假定群體數(shù)目（K值）為1～10并且逐一進(jìn)行測試，每個(gè)K值重復(fù)估算20次，迭代次數(shù)5 000次，馬爾可夫鏈蒙特卡洛方法（Markov chain monte carlo，MCMC）值為50 000次。使用lnP（D）的平均值進(jìn)行種群估計(jì)，并通過Structure Harvester程序估算最佳種群數(shù)量的K值，對群體間及群體內(nèi)分子變異作方差檢驗(yàn)（AMOVA），分析群體內(nèi)、群體間的遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性和遺傳多樣性分析

根據(jù)SSR標(biāo)記的等位變異范圍，進(jìn)行多重電泳組合，本研究將10對引物分為4組來提高電泳效率，圖1為品種SpringPrince的毛細(xì)管電泳結(jié)果。用SSR Analyser軟件處理毛細(xì)管電泳的原始數(shù)據(jù)，從表3可以看出，10對SSR引物在154份材料中共檢測出140個(gè)等位變異位點(diǎn)，變異范圍為8～27，平均值為14；共獲得304個(gè)基因型組合，變化范圍為 17～59個(gè)，平均值為30.4個(gè)。多態(tài)性信息含量能夠反映一個(gè)群體的遺傳變異程度，本研究中，PIC值的變化范圍為0.510 9～0.824 2，平均值為0.698 4，其中PIC值最高的標(biāo)記是SSR125（0.824 2），最低的標(biāo)記是SSR107（0.510 9），各標(biāo)記的PIC值均高于0.5，說明該標(biāo)準(zhǔn)所選引物多態(tài)性較好，適用于桃品種的鑒定，能夠有效反映桃品種的遺傳多樣性信息。供試材料的基因多樣性變化范圍為0.530 8～0.839 6，平均值為0.728 2，表明供試材料的遺傳多樣性豐富，遺傳背景較為復(fù)雜。

154份桃品種中共包括63份申請保護(hù)品種、13份登記品種和78份已知品種，利用GenAlEx6.503對申請和登記的品種與已知品種進(jìn)行群體遺傳多樣性分析（表4）。已知品種的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)分別為12、4.534，Shannons信息指數(shù)（I）為1.762，期望雜合度（H_e）為0.752，均高于申請品種保護(hù)和登記品種，說明已知品種的群體遺傳多樣性比申請品種保護(hù)和登記的品種更豐富。

2.2 聚類分析

本研究通過計(jì)算各品種間的遺傳距離，用UPGMA法對154份桃品種進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)該聚類結(jié)果和品種類型有一定的相關(guān)性（圖2）。154份桃種質(zhì)被劃分為5個(gè)主要類群，其中類群Ⅰ全部為觀賞類桃品種，類群Ⅱ主要是蜜桃品種，類群Ⅲ主要為蟠桃品種，類群Ⅳ主要為黃桃品種，類群Ⅴ主要為油桃品種。觀賞類桃與可食用桃品種間的遺傳信息差異較大，單獨(dú)聚為一類。而其他幾個(gè)類群中存在品種類型相互交叉的現(xiàn)象，如油蟠桃品種在類群Ⅲ、類群Ⅴ中均有分布，類群Ⅱ中除了蜜桃品種外，還有些黃桃品種。在154份材料中，共有2對品種未區(qū)分開，分別是甘峪秋蜜（T101）和中油桃4號（T62），川中島（T102）和中油桃5號（T61），由于該標(biāo)準(zhǔn)選用的是SSR隨機(jī)標(biāo)記，可能未覆蓋相應(yīng)的等位變異差異區(qū)域，因此從分子水平上表現(xiàn)出相似性。除此之外，中蟠9號（T23）和中油蟠9號（T75）、中蟠19號（T26）和中蟠1號（T41）、中桃金霞（T71）和金霞（T78）的遺傳距離最小，均為0.029 3。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同一育種單位的品種聚在一起，遺傳距離較近，如北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院選育的瑞蟠系列品種瑞蟠4號（T22）、瑞蟠21號（T40）和瑞蟠101號（T39），其中瑞蟠21號是由瑞蟠4號為父本雜交選育的極晚熟品種， 瑞蟠101號則是由瑞蟠21號為父本雜交選育的晚熟黃肉品種。此外遺傳距離較近的還有甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所的隴系列品種隴金6號（T96）、隴紅蜜1號（T125）、隴蜜17號（T123）、隴蜜15號（T124）、隴蜜12號（T120）等，其中隴蜜15號和隴蜜12號都是由隴蜜9號為母本雜交選育而來。同一育種單位的品種由于遺傳背景相似而聚在一起，說明該聚類結(jié)果符合實(shí)際育種現(xiàn)狀。為了探討利用該分子數(shù)據(jù)庫在桃特異性、一致性、穩(wěn)定性（DUS）測試中篩選近似品種的可行性，隨機(jī)選取6個(gè)申請品種與對應(yīng)的近似品種進(jìn)行分析。從表5、圖2可以看出，申請品種中油金夏（T43）、中油蜜玉（T44）、金京紅（T153）等對近似品種的選擇比較合理，二者的遺傳距離較近，但是中蟠7號（T18）、中蟠9號（T23）、中桃金飴（T84）在分子水平上有更加近似的品種。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

為了揭示154份桃品種的群體結(jié)構(gòu)，基于貝葉斯的方法分析了不同類型桃品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，當(dāng)K=4時(shí)，似然值最大，如圖3-A、圖3-B 所示。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，將154份桃品種劃分為4個(gè)亞群較為合適，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（圖3-C、圖4）。亞群Ⅰ共有23份材料，主要是蟠桃和蜜桃品種；亞群Ⅱ共有15份材料，主要為觀賞類桃品種；亞群Ⅲ有70份材料，大部分為油桃品種；亞群Ⅳ有46份材料，以蜜桃品種為主。從群體結(jié)構(gòu)來看，大部分材料的親緣關(guān)系比較單一，還有部分材料的親緣關(guān)系比較復(fù)雜。分子變異方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，90%的變異來自于個(gè)體間，個(gè)體間的遺傳變異大于群體間的遺傳變異，同時(shí)群體內(nèi)的遺傳變異遠(yuǎn)高于群體間的遺傳變異（表6）。群體間遺傳分化的程度可以通過遺傳分化指數(shù)來判定^［18］，當(dāng)0≤F_st<0.05時(shí)，表示遺傳分化水平極低；當(dāng)0.05≤F_st<0.15時(shí)，表明遺傳分化處于中等水平；當(dāng)0.15≤F_st<0.25時(shí)，表示遺傳分化較大；當(dāng)F_st≥0.25時(shí)，表示群體間有很大的遺傳分化。本研究中，F(xiàn)_st=0.099，表明該群體間遺傳分化程度中等。

3 討論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，已被廣泛應(yīng)用于各類種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性分析中。近年來，關(guān)于桃種質(zhì)資源的SSR引物的研究也越來越多，Jouy等選出16對具有高多態(tài)性的標(biāo)記用于品種鑒定和保護(hù)^［19］。關(guān)利平等從已發(fā)表的桃基因組SSR引物中篩選出10對核心引物用于指紋庫的構(gòu)建^［20］。本研究所用10對引物的平均PIC值為0.698 4，多態(tài)性含量均大于0.5，高于葉宇蕓等研究中所用的20對SSR引物^［21］。在本研究中，10對引物等位基因平均值和有效等位基因數(shù)（N_a=11.05，N_e=4.168）均顯著高于凌士鵬等的研究結(jié)果^{［14，22-23］}，說明本研究選用的10個(gè)SSR標(biāo)記多態(tài)性較為豐富，可用于桃品種的鑒定和遺傳多樣性分析。相較于李雄偉等構(gòu)建的分子數(shù)據(jù)庫^［13］，本研究所用引物較少，但采用了精度更高的ABI 3730基因分析儀采集指紋，并用SSR Analyser軟件處理，更利于數(shù)據(jù)的整合和可視化。從本研究中的聚類分析結(jié)果來看，報(bào)春（T14）等觀賞桃類單獨(dú)聚在一起，說明觀賞桃與鮮食桃的遺傳差異較大，其起源可能存在較大差異，與周平等的研究結(jié)果^［24］相似。而油蟠類型的品種在前人研究中也很少提到，該聚類結(jié)果顯示，油蟠桃類品種在油桃、蟠桃群體中均有分布，說明油桃、蟠桃這2類群體間的雜交可以創(chuàng)制更多新種質(zhì)。各亞群既有獨(dú)立進(jìn)化，又有部分品種出現(xiàn)高度遺傳混合，亞群內(nèi)品種間遺傳相似度較高，尤其是對于同一育種單位、同一地區(qū)的品種。因此，將不同類型、不同地域的桃品種間進(jìn)行雜交育種，有利于桃種質(zhì)資源的創(chuàng)新。AMONA分析結(jié)果顯示，群體間的遺傳變異小于群體內(nèi)，與王淋等的研究結(jié)果^［3］一致，這種現(xiàn)象在核桃^［25］、油桐^［26］等木本植物中也有發(fā)現(xiàn)，這也與多年生木本植物的遺傳變異規(guī)律^［27-28］相符。

DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建在品種管理和品種保護(hù)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用10個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了154份桃的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，一方面可用于品種真實(shí)性的鑒定、品種管理和維權(quán)等，另一方面還可輔助DUS測試中近似品種的篩選。植物新品種保護(hù)條例規(guī)定，授權(quán)品種必須滿足特異性（distinctness）、一致性（uniformity）和穩(wěn)定性（stability）的要求。近似品種選擇是否合理會直接影響測試品種特異性的審查結(jié)果，而申請者了解的品種有限，原則上近似品種應(yīng)從世界范圍內(nèi)的已知品種中選擇。通過采集申請品種和目前市場上已知品種的指紋信息，構(gòu)建桃分子指紋庫，再利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)輔助篩選近似品種，結(jié)合桃已知品種表型數(shù)據(jù)庫，能夠進(jìn)一步提高近似品種選擇的準(zhǔn)確性，加快品種授權(quán)的速度，并且降低重復(fù)授權(quán)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，還可利用DNA指紋數(shù)據(jù)庫的信息，對申請品種和已知品種進(jìn)行聚類分析，根據(jù)品種間的遺傳距離對品種進(jìn)行分類和區(qū)分，這種方法也能夠較好地輔助近似品種的選擇。目前，DNA指紋數(shù)據(jù)庫已被應(yīng)用于梨^［29］、枇杷^［30］等果樹的近似品種的篩選和特異性判定中。

我國桃種質(zhì)資源豐富，DNA分子標(biāo)記技術(shù)較傳統(tǒng)表型分析具有較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，被廣泛應(yīng)用在桃種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析方面，但是采用的標(biāo)記類型比較單一，后續(xù)可加強(qiáng)對桃品種研究方面新型分子標(biāo)記的開發(fā)，如單核苷酸多態(tài)性（SNP）、表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星（EST-SSR）、多核苷酸多態(tài)性（MNP）等，同時(shí)建立桃品種的DNA指紋庫，利用分子標(biāo)記構(gòu)建品種特異性指紋，為桃品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)服務(wù)。

4 結(jié)論

本研究利用10對SSR核心引物構(gòu)建了154份桃品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，能夠進(jìn)行品種鑒定并輔助DUS測試中近似品種的篩選。分析申請品種與已知品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)已知品種的遺傳多樣性更加豐富，同一育種單位的品種遺傳距離較近，群體間的遺傳分化程度呈中等水平，可為我國桃種質(zhì)資源的創(chuàng)新提供一定參考價(jià)值。

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