酵母中乙酰輔酶A的代謝工程研究進(jìn)展

王招懸,劉營(yíng)航,劉萌萌,祁慶生

(山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(微生物技術(shù)研究院),山東 青島 266200)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,利用生物技術(shù)將可再生碳源轉(zhuǎn)化為工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品已成為理想選擇。代謝工程通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的通量平衡達(dá)到生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的目的[1]。代謝工程通常致力于滿足經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和提高產(chǎn)品滴度、產(chǎn)量和速率的需求[2],滿足這些需求通常不僅需要優(yōu)化產(chǎn)物合成的代謝產(chǎn)物途徑,而且還需要改造細(xì)胞的中心碳代謝途徑[3]。

乙酰輔酶A(acetyl-CoA)是微生物中心碳代謝的初級(jí)代謝物,參與許多代謝途徑,因此代表了代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[4]。它由輔酶A和乙酸通過硫酯鍵連接組成,充當(dāng)中間分子,可以在分子之間轉(zhuǎn)移乙酰基,直接參與三羧酸循環(huán)(TCA)、脂類代謝、萜類代謝和氨基酸代謝等生化反應(yīng)。乙酰輔酶A還被用于生產(chǎn)各種高值的平臺(tái)化學(xué)品,包括脂肪酸、1-丁醇、聚羥基鏈烷酸酯、萜類、聚酮化合物和類異戊二烯等。因此,許多代謝工程學(xué)者致力于增加細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的水平,以此用作一系列不同產(chǎn)品的前體[3]。

與原核生物相比,酵母中乙酰輔酶A的代謝是分區(qū)室進(jìn)行的,在細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體和細(xì)胞核中都存在乙酰輔酶A的代謝途徑,且不同的區(qū)室之間乙酰輔酶A不能自由穿梭[5]。此外,酵母中乙酰輔酶A合成酶(ACS)對(duì)底物親和力較低,并需要消耗能量,是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的一個(gè)關(guān)鍵限速步驟。由于酵母中乙酰輔酶A的分區(qū)現(xiàn)象,只將ACS過表達(dá)難以增加總的乙酰輔酶A的含量[6],因此,研究人員常用代謝工程改造乙酰輔酶A的合成途徑,以大幅提高酵母乙酰輔酶A的含量。

研究者已經(jīng)使用了多種策略來提高胞內(nèi)乙酰輔酶A的供應(yīng),包括丙酮酸脫氫酶(PDH)旁路途徑、PDH途徑、磷酸轉(zhuǎn)酮酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PK-PTA)途徑以及檸檬酸裂解、β-氧化和添加乙酸以增加乙酰輔酶A的含量[7-10],還有研究者引入了異源的乙酰輔酶A合成途徑,以達(dá)到增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的最終目的[6-11]。本文在概述酵母乙酰輔酶A的代謝途徑基礎(chǔ)上,總結(jié)酵母代謝工程中增加乙酰輔酶A的策略及研究進(jìn)展。

1 酵母中乙酰輔酶A代謝途徑

酵母中的乙酰輔酶A代謝途徑主要存在于胞質(zhì)(胞漿、細(xì)胞器)以及細(xì)胞核中(圖1)。在目前的代謝工程改造中,大多數(shù)參與乙酰輔酶A合成途徑的酶通常在酵母胞漿中表達(dá),因此產(chǎn)物產(chǎn)量取決于胞漿中乙酰輔酶A的含量[12]。在細(xì)胞質(zhì)中,有2種需要消耗ATP合成乙酰輔酶A的途徑:一是PDH旁路途徑,即從丙酮酸到乙醛再到乙酸,最后生成乙酰輔酶A;另一個(gè)是檸檬酸裂解酶(ACL)途徑,以檸檬酸為底物,消耗1分子ATP,生成乙酰輔酶A和草酰乙酸[13]。

胞質(zhì)中的PDH旁路途徑是釀酒酵母生產(chǎn)乙酰輔酶A的主要途徑,該途徑的關(guān)鍵在于acs基因。ACL途徑則是產(chǎn)油酵母所特有的乙酰輔酶A合成途徑,如解脂耶氏酵母中的ACL基因能夠高效催化檸檬酸產(chǎn)生乙酰輔酶A。在代謝工程改造中,通常借鑒2種酵母的優(yōu)勢(shì)途徑,由此提高胞質(zhì)中乙酰輔酶A 的含量。

除胞漿外,線粒體和過氧化物酶體等細(xì)胞器也是重要的乙酰輔酶A生成場(chǎng)所。細(xì)胞器中合成乙酰輔酶A的途徑有4種:一是線粒體中的PDH途徑,由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化丙酮酸生成乙酰輔酶A;二是線粒體中通過支鏈氨基酸(亮氨酸和賴氨酸)和脂肪酸的降解來產(chǎn)生乙酰輔酶A;三是過氧化物酶體中乙酰輔酶A合成酶催化乙酸合成;最后一個(gè)是在過氧化物酶體中通過脂肪酸的β-氧化合成[14]。另外,由線粒體中相關(guān)途徑產(chǎn)生的一部分乙酰輔酶A也可能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中用于脂肪酸合成[15]。

1.1 胞質(zhì)中乙酰輔酶A合成途徑

PDH旁路途徑是酵母胞質(zhì)中的乙酰輔酶A生產(chǎn)途徑,由丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰輔酶A合成酶(ACS)組成。PDH旁路途徑是厭氧條件下酵母細(xì)胞能夠進(jìn)入TCA循環(huán)的關(guān)鍵途徑。當(dāng)酵母細(xì)胞在厭氧條件下生長(zhǎng)時(shí),丙酮酸脫氫酶的酶活性受到抑制[16-17],因此,在厭氧條件下,PDH途徑不能為TCA循環(huán)提供乙酰輔酶A。而PDH旁路途徑中丙酮酸脫羧酶的活性卻不會(huì)因厭氧條件而被抑制,因此糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸經(jīng)過丙酮酸脫羧酶產(chǎn)生乙醛,然后將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸,最后生成乙酰輔酶A[18-19]。在PDH旁路途徑中,乙醛脫氫酶(ALD2-6)以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或NADP+作為輔因子將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸酯[20];ACS1/2催化的是從乙酸合成乙酰輔酶A,這一步中ATP被水解為AMP[21-22]。整個(gè)過程消耗2個(gè)ATP,而ATP的消耗會(huì)降低以葡萄糖為底物生產(chǎn)的乙酰輔酶A衍生物的產(chǎn)量[22]。

檸檬酸裂解途徑的酶是ATP:檸檬酸裂解酶(ACL),ACL是糖代謝和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶,它作用的底物和產(chǎn)物都是糖代謝中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物。檸檬酸裂解酶在生物體中發(fā)揮重要的作用,如,生成胞間乙酰輔酶A、作為脂肪酸合成的調(diào)控酶、提高產(chǎn)油作物的產(chǎn)油量、提高植物的抗逆性以及參與有性生殖的調(diào)節(jié)等[23]。

由于乙酰輔酶A無法穿過線粒體膜,因此需要利用TCA循環(huán)生成的檸檬酸進(jìn)行穿梭,即線粒體中的乙酰輔酶A在檸檬酸合酶的作用下先與草酰乙酸生成檸檬酸,然后檸檬酸通過檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)穿過線粒體到細(xì)胞質(zhì)中,在ACL的作用下與CoA生成乙酰輔酶A和草酰乙酸,ACL能將1分子檸檬酸裂解為1分子乙酰輔酶A和1分子草酰乙酸,消耗1分子ATP[24],通過間接將線粒體中的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中乙酰輔酶A的積累。以這種方式提供胞質(zhì)乙酰輔酶A也依賴于線粒體形成檸檬酸的活性,且酵母細(xì)胞中葡萄糖會(huì)抑制線粒體活性,這種抑制則可能影響線粒體中檸檬酸的形成及其在線粒體和細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[25]。

磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)是在異型發(fā)酵和兼性同型發(fā)酵乳酸菌以及雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)的,用于替代糖酵解途徑來異化葡萄糖的酶[26]。PK同時(shí)具有木酮糖-5-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶和果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶2種活性,分別作用于木酮糖-5-磷酸和果糖-6-磷酸,產(chǎn)生1分子的二碳單元乙酰磷酸,剩余的碳單元甘油醛-3-磷酸以及赤蘚糖-4-磷酸則進(jìn)入戊糖磷酸途徑回收利用[27]。磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)則在此之后將乙酰磷酸催化成乙酰輔酶A。在此途徑中,PK以1分子果糖-6-磷酸、木酮糖-5-磷酸或核酮糖-5-磷酸為底物,將糖磷酸鹽和無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為1分子乙?；?磷酸和赤蘚糖-4-磷酸或甘油醛-3-磷酸[28],乙酰磷酸進(jìn)而再被PTA催化生成乙酰輔酶A,或被乙酰激酶催化生成乙酸,最后由乙酰輔酶A合成酶催化生成乙酰輔酶A,最終1分子葡萄糖通過PK-PTA途徑合成3分子乙酰輔酶A,消耗1分子ATP,比PDH旁路途徑多合成1分子乙酰輔酶A,少消耗1分子ATP[29]。

1.2 細(xì)胞器中乙酰輔酶A合成途徑

PDH旁路途徑是線粒體中由丙酮酸產(chǎn)生乙酰輔酶A的途徑。經(jīng)糖酵解產(chǎn)生并進(jìn)入線粒體部分的丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶(PDH)復(fù)合體催化生成乙酰輔酶A。PDH復(fù)合體是釀酒酵母中最復(fù)雜的蛋白復(fù)合體之一,由E1、E2、E3和6種輔因子(二磷酸硫胺、硫辛酸、FAD、CoA、NAD+和Mg2+)構(gòu)成,它不可逆地催化丙酮酸生成乙酰輔酶A,同時(shí)釀酒酵母可從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)PDH 復(fù)合體進(jìn)行調(diào)控[30]。硫胺素焦磷酸與E1結(jié)合并參與丙酮酸脫羧;硫辛酸酯共價(jià)連接到E2的保守賴氨酸殘基上,并介導(dǎo)E1、E2和E3活性位點(diǎn)之間的中間體易位,而黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和NAD+是E3對(duì)二氫硫辛酸酯再氧化所必需的[31]。然而,乙酰輔酶A不能自由地在不同細(xì)胞器之間穿梭[32],只可通過乙醛酸循環(huán)或肉堿/乙酰肉堿穿梭作用提供給其他區(qū)室[33],所以酵母線粒體中的PDH旁路途徑不能滿足胞質(zhì)乙酰輔酶A需求[34]。因此,在酵母中引入了細(xì)菌的PDH旁路途徑,可以在細(xì)胞質(zhì)中利用PDH旁路途徑產(chǎn)生更多的乙酰輔酶A[10]。

通過降解支鏈氨基酸(如亮氨酸)也可以合成乙酰輔酶A。在真菌中,L-賴氨酸可由α-氨基己二酸途徑的可逆反應(yīng)而降解,該途徑的前半部分開始于賴氨酸逐步降解為糖精、2-氨基己二酸酯-6-半醛、2-氨基己二酸酯、戊二酰二氫脂酰胺和戊二酰輔酶A,然后戊二酰輔酶A通過一系列?；o酶A中間體修飾以生成乙酰輔酶A[35]。

1.3 乙酰輔酶A的降解途徑

乙酰輔酶A最重要的降解途徑是乙醛酸途徑。在這個(gè)途徑中,胞質(zhì)乙酰輔酶A和乙醛酸在蘋果酸合酶(MLS)的催化下生成蘋果酸,蘋果酸脫氫生成草酰乙酸,草酰乙酸再與乙酰輔酶A生成檸檬酸。此過程會(huì)消耗乙酰輔酶A結(jié)合生成琥珀酸以合成葡萄糖[36]。在釀酒酵母中,乙酰輔酶A會(huì)流向脂肪酸和甾醇的代謝,參與蛋白質(zhì)的乙?；^程[37]。在解脂耶氏酵母中,大多數(shù)胞質(zhì)乙酰輔酶A均流向脂質(zhì)生物合成。因此,調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中乙酰輔酶A的降解途徑對(duì)于提高異源代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要。

2 提高乙酰輔酶A產(chǎn)量的代謝工程策略

2.1 PDH旁路途徑

通過PDH旁路途徑基因的過表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的增加。對(duì)PDH旁路途徑的優(yōu)化,可以使酵母細(xì)胞工廠表現(xiàn)出更佳的乙酰輔酶A衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)。對(duì)PDH旁路途徑的改造主要集中在ADH、ALD和ACS等酶的改造。錢泓[7]考察單獨(dú)或組合ACS和ALD的過表達(dá)來研究其對(duì)乙酰輔酶A產(chǎn)量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在釀酒酵母中過表達(dá)了ALD6,乙酰輔酶A的含量在搖瓶水平和發(fā)酵罐水平,分別提高了41.59%和24.62%;單獨(dú)過表達(dá)ACS1及ACS2,而過表達(dá)ACS1的細(xì)胞中乙酰輔酶A的含量在搖瓶水平和發(fā)酵罐水平分別提高了44.34%和56.34%,而過表達(dá)ACS2產(chǎn)生乙酰輔酶A的含量則分別提高了42.60%和30.94%;對(duì)ACS1定點(diǎn)突變后,乙酰輔酶A的含量提高了1.04倍;共表達(dá)ALD6和ACS1,導(dǎo)入雙倍體菌株中,乙酰輔酶A的含量提高了63.70%;再將共表達(dá)片段轉(zhuǎn)入單倍體菌株中,乙酰輔酶A的含量提高了1.5倍。

引入外源基因以替代酵母內(nèi)源基因亦會(huì)對(duì)乙酰輔酶A及終產(chǎn)物產(chǎn)生影響,Song等[38]在釀酒酵母中引入了密碼子優(yōu)化的大腸桿菌乙?；胰┟摎涿富騟utE,并刪除ALD6的編碼基因,成功提高了細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的水平,并使終產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量在40 h內(nèi)達(dá)到142 g/L。

Shiba等[6]研究發(fā)現(xiàn),改造釀酒酵母PDH旁路途徑中的adh、ald6和acs基因可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的供應(yīng),從而增加倍半萜烯化合物嗎啡二烯的產(chǎn)量。為了在解脂耶氏酵母細(xì)胞質(zhì)中提供更多的乙酰輔酶A,Chen等[39]使用可響應(yīng)不同葡萄糖濃度的HXT7啟動(dòng)子過表達(dá)內(nèi)源性ADH2編碼基因、乙酰轉(zhuǎn)移酶ERG10編碼基因以及ALD6編碼基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些基因的過表達(dá)使α-檀香烯的產(chǎn)量提高了4倍。Liu等[40]對(duì)ALD6、ACS1/ACS2和ADH2進(jìn)行過表達(dá)后發(fā)現(xiàn),同時(shí)過表達(dá)ADH2、ALD6、ACS1時(shí)β-amyrin產(chǎn)率最高,為(4.4±0.2) mg/g,與對(duì)照菌株相比提高了42%。Kocharin等[11]在釀酒酵母中將含有ADH2、ALD6、ERG10和來自Salmonellaenterica變體的ACS(ACSL641P)的乙酰輔酶A增強(qiáng)質(zhì)粒和含有編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(PhaA)、NADPH連接的乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)和來自RalstoniaeutrophaH16的聚3-羥基丁酸酯聚合酶(PhaC)基因的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)進(jìn)釀酒酵母,工程菌上罐發(fā)酵36 h后,PHB的滴度為43.11 mg/L。Liu等[41]基于畢赤酵母構(gòu)建了一個(gè)新的生物合成系統(tǒng)(ESAD),以生產(chǎn)莫納克林L(DML)的菌株為例來測(cè)試ESAD系統(tǒng),以此表達(dá)了異源的DML合成途徑的基因,并使用GAP啟動(dòng)子來組成過表達(dá)ADH2和乙酰化位點(diǎn)突變體ACS1與巴斯德畢赤酵母ACC1(ACC1的保守位點(diǎn)突變)[13]以增加乙酰輔酶A的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):基因的共同過表達(dá)可改善DML的生物合成,并且通過增強(qiáng)乙醇轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A的代謝步驟,DML的產(chǎn)量提高了2倍,達(dá)到125.6 mg/L。

2.2 檸檬酸裂解途徑

在酵母中,檸檬酸主要在線粒體中產(chǎn)生,在TCA循環(huán)中被消耗。線粒體中生成的檸檬酸一部分被檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CTP1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)[42],經(jīng)ACL催化產(chǎn)生胞質(zhì)乙酰輔酶A。在代謝工程改造中,常過表達(dá)或引入外源ACL基因以增加胞質(zhì)乙酰輔酶A的含量。Jin等[8]在解脂耶氏酵母中過表達(dá)ACL2增加乙酰輔酶A水平,使總?cè)坪桶讟逅岬漠a(chǎn)量分別增加1.23和1.30倍。Huang等[36]以解脂耶氏酵母為模型,利用新構(gòu)建的基因組級(jí)代謝模型分析代謝網(wǎng)絡(luò),將異源ACS或內(nèi)源性ACL1基因過表達(dá),使胞質(zhì)乙酰輔酶A的含量增加50%以上。Liu等[40]引入異源乙酰輔酶A合成途徑——ACL途徑,并在培養(yǎng)基中添加檸檬酸以提高β-amyrin產(chǎn)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)添加1 g/L檸檬酸時(shí),β-amyrin的最高產(chǎn)率達(dá)到(4.2±0.4) mg/g,提高了36%。在產(chǎn)油酵母中,控制檸檬酸通量從TCA循環(huán)向ACL轉(zhuǎn)移的主要調(diào)節(jié)機(jī)制是由抑制線粒體異檸檬酸脫氫酶(ICDH)實(shí)現(xiàn)的[43]。釀酒酵母包含NADP+和NAD+依賴性線粒體ICDH,在野生型細(xì)胞中,NAD+依賴的線粒體ICDH介導(dǎo)了大部分細(xì)胞通量分配[44-45]。因此,為增加釀酒酵母檸檬酸的含量以促進(jìn)ACL途徑產(chǎn)生乙酰輔酶A,Rodriguez等[46]結(jié)合ACL基因的過表達(dá)和敲除線粒體NAD+依賴的異檸檬酸脫氫酶(IDH1)基因,使甲羥戊酸的產(chǎn)量比對(duì)照組增加了3倍。

2.3 PDH途徑

酵母胞質(zhì)中沒有內(nèi)源的PDH途徑,因此,為增加胞質(zhì)乙酰輔酶A含量,許多研究引入了外源的PDH途徑。Liu等[10]將細(xì)菌復(fù)雜的PDH途徑與解脂耶氏酵母的代謝相結(jié)合,組裝了編碼PDH的3個(gè)催化亞基E1、E2和E3的基因[47],這3個(gè)基因一起組裝后再與G.hybrida的2-吡喃酮合酶(GH2PS)一起過表達(dá)。脂蛋白連接酶A在PDH的E2亞基脂化中起關(guān)鍵作用[4,48]。因此,Liu等[10]共表達(dá)了脂酸鹽-蛋白質(zhì)連接酶A(LplA),使三乙酸內(nèi)酯(TAL)產(chǎn)量增加了1.5倍,達(dá)到0.67 g/L。Zhang等[49]在釀酒酵母胞質(zhì)中表達(dá)了由pdhA、pdhB、aceF和lpd及來自E.faecalis的lplA和lplA2編碼的PDH復(fù)合體,同時(shí)表達(dá)了脂酸連接酶以及Streptococcusmutans中的NADP+依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GapN),在表達(dá)胞質(zhì)丙酮酸復(fù)合體前還刪除了酵母細(xì)胞內(nèi)的磷脂酸磷酸酶基因(pah1、dpp1和lpp1)和主要的固醇酯形成基因are1,最終得到的菌株,在NAD+依賴性甘油-3-磷酸脫氫酶編碼基因gpd1和gpd2缺失的條件下,游離脂肪酸(FFA)產(chǎn)量增加了83%,達(dá)到840.50 mg/L。

在PDH途徑中,除E1、E2和E3這3個(gè)PDH亞基外,還有6個(gè)重要的輔因子,因此對(duì)輔因子進(jìn)行改造也可增加乙酰輔酶A含量。Cardenas等[50]對(duì)釀酒酵母中的輔因子和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行了改造,以增強(qiáng)乙酰輔酶A和聚酮化合物的生物合成。在酵母中表達(dá)了大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDHm)的NADP+變體[51],并將NADPH/NADP+的比率和乙酰輔酶A產(chǎn)量與基礎(chǔ)菌株進(jìn)行了比較,隨后將PDHm過表達(dá)與葡萄糖6-磷酸脫氫酶zwf1基因缺失相耦聯(lián),進(jìn)一步驅(qū)使碳通量流向乙酰輔酶A,額外的途徑設(shè)計(jì)結(jié)合了關(guān)鍵的基因破壞,從而減少了丙酮酸和乙酰輔酶A的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):分批培養(yǎng)24 h時(shí),表達(dá)PDH和PDHm菌株的乙酰輔酶A含量分別增加了2.3和2.4倍;將zwf1基因敲除與PDHm過表達(dá)結(jié)合時(shí),乙酰輔酶A含量增加了3倍,并導(dǎo)致TAL的含量增加了4.5倍。

2.4 氨基酸途徑

盡管以上途徑都不同程度地增加了乙酰輔酶A的含量,但由丙酮酸或檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A必定會(huì)導(dǎo)致碳損失[52],因此有必要開發(fā)以其他前體途徑來增加乙酰輔酶A含量。

利用氨基酸合成途徑來增加乙酰輔酶A的含量。Kim等[18]通過操縱TCA循環(huán)中間體的利用途徑(如蘇氨酸生物合成途徑)來增加通過TCA循環(huán)的通量,還利用氨基酸生物降解途徑來增加乙酰輔酶A的含量。然而這些策略只存在理論階段,需要進(jìn)一步的應(yīng)用研究。

Liu等[53]通過增強(qiáng)輔酶A的合成來提高乙酰輔酶A的產(chǎn)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在釀酒酵母中,泛酸激酶(PanK)由cab1基因編碼,為了提高輔酶A的合成,在強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(截短的HXT7啟動(dòng)子)下過表達(dá)cab1,使柚皮素達(dá)到0.88 mg/L,與未表達(dá)cab1基因的對(duì)照相比,柚皮素的產(chǎn)量提高了2倍。

2.5 乙酰輔酶A降解途徑

調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中乙酰輔酶A的競(jìng)爭(zhēng)途徑對(duì)于提高異源代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要。一方面,可使用抑制劑來阻斷下游產(chǎn)物的生成。Marsafari等[54]使用淺藍(lán)菌素作為抑制劑,抑制3-酮?；?ACP合酶Ⅰ和Ⅱ來阻斷脂質(zhì)的合成,最終使目標(biāo)產(chǎn)物紫杉二烯產(chǎn)量達(dá)到171.45 mg/L,提高了231.13%。另一方面,可敲除乙酰輔酶A生成過程中的競(jìng)爭(zhēng)途徑。在釀酒酵母中,Lian等[55]通過敲除編碼催化乙醇形成的基因adh1和adh4以及催化產(chǎn)生甘油的基因gpd1和gpd2,使糖酵解通量更多流向乙酰輔酶A,最終使正丁醇產(chǎn)量提高4倍。

在過氧化物酶體中,乙酰輔酶A能通過ACS1催化乙酸生成乙酰輔酶A[56],Cit2和Mls1分別催化乙酰輔酶A與草酰乙酸或乙醛酸的縮合反應(yīng),乙酰輔酶A在過氧化物酶體中通過乙醛酸途徑轉(zhuǎn)變成四碳有機(jī)物(蘋果酸和琥珀酸)[39]。迄今為止,對(duì)酵母中過氧化物酶體的乙酰輔酶A生成途徑的改造很少,主要是敲除cit2和mls1以阻斷乙酰輔酶A流向乙醛酸途徑,增加胞質(zhì)中乙酰輔酶A的積累。如,Huang等[36]為保障乙酰輔酶A流向目標(biāo)產(chǎn)物,分別將解脂耶氏酵母中編碼過氧化物酶體檸檬酸合酶和蘋果酸合酶的基因cit2和mls1敲除,結(jié)果發(fā)現(xiàn):這2種基因的缺失都有利于胞質(zhì)乙酰輔酶A的積累,其中cit2基因的去除使乙酰輔酶A產(chǎn)量增加了66.7%。Chen等[39]在釀酒酵母菌株中敲除cit2和mls1,以乙醇為碳源,改造菌株的α-檀香烯產(chǎn)率提高了2～3倍。

2.6 PK-PTA途徑

在酵母細(xì)胞質(zhì)中引入PK和PTA的基因,使酵母能夠通過PK-PTA途徑來生成乙酰輔酶A,利用PK-PTA代謝途徑來增加合成乙酸和乙酰輔酶A的碳流量。目前,在釀酒酵母中成功異源表達(dá)PK和PTA[9],并將此途徑與胞質(zhì)中其他途徑(如PDH旁路途徑及乙酰輔酶A降解途徑)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)增加乙酰輔酶A含量的目的。

Murarka等[9]在釀酒酵母中表達(dá)PK、PTA、乙酰化乙醛脫氫酶(A-ALD)和NADH-HMGr,以此重新構(gòu)建乙酰輔酶A的代謝途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn):這不僅可以降低乙酰輔酶A合成過程中能量的需求和碳的損失,還能平衡途徑中的NADH,最終以葡萄糖為底物,重組菌株的法尼烯產(chǎn)量增加了25%。Meadows等[57]通過乙酰磷酸(ACP)來產(chǎn)生乙酰輔酶A,該途徑繞過CO2釋放反應(yīng)來保存碳[29,58],并用乙?；腁LD替代釀酒酵母的ALD6、ACS1和ACS2,用NADH特異性HMG輔酶A(NADH-HMGr)替換依賴NADPH的天然HMGr,以減少法呢烯合成過程中輔因子使用的變化,最終在過表達(dá)ADA、NADH-HMGr、PK和PTA且刪除甘油-3-磷酸酶(RHR2)基因的條件下,法呢烯的時(shí)空產(chǎn)率為2.24 g/(L·h),產(chǎn)量提高了17.3%。Liu等[40]表達(dá)5-磷酸木酮糖(X5P)特異性PK和PTA,將PK-PTA途徑與其他乙酰輔酶A供應(yīng)途徑整合,結(jié)果發(fā)現(xiàn):輔酶A與大腸桿菌的乙酰化乙醛脫氫酶(A-ALD)共表達(dá)可催化乙醛向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化;此外,用NADH-HMGr替換天然依賴NADPH的HMGr,同時(shí)破壞菌株中的乙醛酸途徑以進(jìn)一步去除乙酰輔酶A的競(jìng)爭(zhēng)途徑,最終在過氧化物酶體檸檬酸合酶基因(cit2)缺失的條件下,β-amyrin的產(chǎn)量提高了42%。

PK-PTA途徑還可以耦合外源的非氧化糖酵解(NOG)途徑,一同增加乙酰輔酶A含量。Qiao等[59]為使解脂耶氏酵母中脂質(zhì)的產(chǎn)量最大化,設(shè)計(jì)解脂耶氏酵母工程化胞質(zhì)非氧化糖酵解(NOG)途徑,使糖代謝繞過糖酵解(EMP)途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn):該策略可由1 mol葡萄糖產(chǎn)生3 mol乙酰輔酶A;為激活NOG途徑,在菌株中同時(shí)表達(dá)了PK和PTA,最終重組菌株在搖瓶發(fā)酵中細(xì)胞干質(zhì)量增加了41%,脂質(zhì)含量增加了16.4%。

在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),丙酮酸可以通過丙酮酸氧化酶(PO)催化脫羧生成乙酰磷酸,隨后,PTA將乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。為了恢復(fù)丙酮酸羧化酶缺陷(PDC-)釀酒酵母菌株在過量葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性能,Dai等[60]在PDC-釀酒酵母菌中建立了不依賴ATP的胞質(zhì)乙酰輔酶A生成途徑,用異源的PTA和PO替代天然的乙酰輔酶A合成酶ACS1和ACS2,結(jié)果發(fā)現(xiàn):該策略的比生長(zhǎng)速率為0.086 h-1;在此條件下,乙酰輔酶A衍生物法呢烯和3-羥基丙酸的產(chǎn)量分別為20.50和61.40 mg/L。

代謝工程的最新研究進(jìn)展為生產(chǎn)所需化合物提供了理論和實(shí)踐的指導(dǎo)。乙酰輔酶A是微生物細(xì)胞內(nèi)一個(gè)非常重要的中間代謝產(chǎn)物,不僅參與多種代謝途徑,維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)水平,同時(shí)也是多種化合物的前體。表1列出了部分酵母提高乙酰輔酶A的策略。通常,研究人員采取的措施包括過表達(dá)天然乙酰輔酶A合成途徑中關(guān)鍵基因,刪除或弱化下游競(jìng)爭(zhēng)途徑,在酵母中引入異源的乙酰輔酶A合成途徑以及通過引入異源的基因與天然乙酰輔酶A合成途徑進(jìn)行重新連接。

表1 酵母提高乙酰輔酶A產(chǎn)量的策略

3 總結(jié)與展望

代謝工程的操作工具和生物信息學(xué)的發(fā)展為生物合成途徑的進(jìn)一步設(shè)計(jì)提供了條件,基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)分析,特別是機(jī)器學(xué)習(xí),為開發(fā)新的代謝工程策略以增加各種化合物的生產(chǎn)率和產(chǎn)量提供了有效的方法。如大腸桿菌存在的NOG途徑、反向乙醛酸途徑、丙二酰輔酶A-甘油途徑和蘇氨酸旁路途徑。若將大腸桿菌中的反向乙醛酸途徑、丙二酰輔酶A-甘油途徑和蘇氨酸旁路途徑結(jié)合在一起,能實(shí)現(xiàn)由1分子的磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸生成2分子的乙酰輔酶A,這為酵母的乙酰輔酶A代謝工程設(shè)計(jì)提供了借鑒。此外,一些新興的基因編輯技術(shù)和工具也可為酵母代謝工程提高乙酰輔酶A產(chǎn)量提供有效的方法,如CRISPR-CAS9、胍基/胸腺嘧啶(GT)DNA組裝標(biāo)準(zhǔn)GTS、pMRI介導(dǎo)的分散組裝、染色體整合技術(shù)以及模塊化控制系統(tǒng)等。

總之,本文綜述了酵母中乙酰輔酶A的代謝途徑和代謝工程方法,通過不同種類酵母的乙酰輔酶A代謝途徑的比較和分析,為提高酵母代謝工程提供了依據(jù),也為利用酵母進(jìn)行綠色制造提供了幫助。