結(jié)直腸癌干細(xì)胞中miR-520c-3p的表達(dá)及其對丙酮酸代謝的調(diào)控機(jī)制研究

趙英旋，白玉勤，歐陽衛(wèi)東

（1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院 普外四科，內(nèi)蒙古 赤峰 024005；2.內(nèi)蒙古赤峰市腫瘤醫(yī)院 病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024005）

丙酮酸的代謝途徑取決于細(xì)胞當(dāng)時的條件以及有機(jī)體種類或組織的類型[1]。大多數(shù)分化的哺乳動物細(xì)胞將丙酮酸導(dǎo)入線粒體，在那里被氧化以產(chǎn)生高效的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[2]。然而，癌細(xì)胞將丙酮酸及其前體轉(zhuǎn)用于其他合成代謝過程，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為乳酸排出細(xì)胞外[3]。這種代謝適應(yīng)是由生物化學(xué)家Otto Warburg在20世紀(jì)20年代首次描述的，被稱為Warburg 效應(yīng)。多種機(jī)制促成了癌癥的這種代謝失調(diào)，但丙酮酸的合成和代謝起著核心作用[4-7]。丙酮酸代謝的改變似乎是促成和促進(jìn)許多癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，包括結(jié)直腸癌[8-12]。但是，目前對這一過程在分子水平上的調(diào)控研究很少。microRNA（miRNA）是一種長度約為19～24 nt 的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過靶向靶基因mRNA 的3'端非編碼區(qū)，引起轉(zhuǎn)錄抑制或調(diào)節(jié)mRNA降解[13-14]。Deng等[15]報道，miR-23a在結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的過表達(dá)間接促進(jìn)了參與氧化磷酸化的丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）的激活，從而產(chǎn)生足夠的ATP 用于腫瘤細(xì)胞增殖。然而，結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中存在多種miRNA 的表達(dá)失調(diào)，這種失調(diào)是否影響結(jié)直腸癌干細(xì)胞的丙酮酸代謝仍然未知。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并且高表達(dá)miR-520c-3p 的結(jié)直腸癌患者有較差的預(yù)后。但是，miR-520c-3p 是否參與丙酮酸代謝尚不清楚?；诖耍狙芯恐荚谔接憁iR-520c-3p 調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞丙酮酸代謝的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HCT-116 細(xì)胞株購自寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司（貨號：RX1525）。HT-29 細(xì)胞株購自深圳市文樂生物科技有限公司（貨號：iCell-h078）。SW-1116 細(xì)胞株購自上海信裕生物科技有限公司（貨號：26-5140）。DMEM 培養(yǎng)基購自北京賽音圖科技有限公司（貨號：C11995500BT）。MPC1 抗體購自廣州吉英生物科技有限公司（貨號：42898）。GAPDH 抗體購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司（貨號：BCJ200003H）。miR-520c-3p 模擬物（mimics）和miR-520c-3p 抑制物（inhibitor）由北京擎科設(shè)計合成。含MPC1 抑制物（shMPC1）和陰性對照序列（shNC） 的慢病毒由漢坦生物提供。L-乳酸檢測試劑盒購自北京軒澤偉業(yè)科技有限公司（貨號：K-LATE）。葡萄糖檢測試劑盒購自北京奇松生物科技有限公司（貨號：BQS118529-100T）。CyQuant 細(xì)胞增殖測定試劑盒購自ThermoFisher 公司（貨號：C7026）。RNeasy Mini Kit 購自北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司（貨號：74134）。高容量cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermoFisher 公司（貨號：4374967）。SYBR Green I Master Mix 購自北京擎科生物科技有限公司（貨號：TSE203）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理根據(jù)文獻(xiàn)[16]，應(yīng)用無血清的腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基分別從HCT-116、HT-29、SW-1116 細(xì)胞株中分離純化人結(jié)直腸癌干細(xì)胞株 HCT-116CSC、 HT-29CSC、 SW-1116CSC。HCT-116CSC、HT-29CSC、SW-1116CSC 置于含各種生長因子無血清DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HCT-116、HT-29、SW-1116、細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集分析根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih.gov） 數(shù)據(jù)集 COAD 和COADREAD，利用Survexpress 比較目標(biāo)基因高表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的生存狀況。

1.2.3 葡萄糖和乳酸含量的檢測乳酸含量通過使用L-乳酸檢測試劑盒進(jìn)行測定。葡萄糖通過葡萄糖檢測試劑盒進(jìn)行檢測。將結(jié)直腸癌干細(xì)胞HCT-116CSC、HT-29CSC、SW-1116CSC 在DMEM 基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后根據(jù)制造商的說明收集細(xì)胞并進(jìn)行乳酸或葡萄糖含量測定。

1.2.4 Western blot結(jié)直腸癌干細(xì)胞使用裂解緩沖液50 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，10% Glycerol，1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl，1.0 mmol/L EGTA，10 mmol/L 焦磷酸鈉，100 mmol/L 氟化鈉，1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解。樣品的蛋白質(zhì)濃度通過BCA 檢測進(jìn)行量化，并進(jìn)行歸一化處理，以確保各孔之間的樣品負(fù)荷恒定。然后對樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和免疫印跡。用18%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行解析，并轉(zhuǎn)移到甲醇激活的0.45 μm Immobilon FL PVDF 膜上。在2.5%的牛奶中阻斷1 h 后，清洗膜并使用在含有0.1% Tween-20 的TBS 中制成的5% BSA 溶液中稀釋的特異性抗體進(jìn)行檢測。洗滌膜并使用熒光共軛二抗進(jìn)行探測，并使用LI-COR Biosciences Odyssey 系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.2.5 質(zhì)量同位素分析所有的13C 研究都是在含有10%透析FBS 的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，準(zhǔn)備時要使葡萄糖或谷氨酰胺池100%被標(biāo)記為13C，而另一個池則未被標(biāo)記。缺少葡萄糖和谷氨酰胺的DMEM 由粉末制備，然后補(bǔ)充15 mmol/LD-（U-13C）葡萄糖。細(xì)胞在60 或100 mm 的盤子里生長到80%匯合，然后用PBS 沖洗，用含13C 的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。然后在0.5 mL 1∶1 的冷甲醇：水的混合物中凍融3 次，提取細(xì)胞。通過離心除去大分子和碎片，加入50 nmoL 的2-氧代丁酸，完全蒸發(fā)帶有水樣代謝物的上清液，并在42 ℃下在100 μL 的三甲基硅基供體中衍生30 min。使用與Agilent 5973 質(zhì)量選擇檢測器聯(lián)網(wǎng)的Agilent 6970 氣相色譜儀對代謝物進(jìn)行分析。所有代謝物的保留時間和質(zhì)量碎片特征都用純標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證。為了確定不同樣品的相對代謝物豐度，將代謝物的總離子流峰的面積與內(nèi)標(biāo)的面積進(jìn)行比較，并對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行歸一化。質(zhì)量同位素分布分析測量了每個代謝物池中包含所有可能數(shù)量的13C 原子的部分；也就是說，一個代謝物可能包含0、1、2...n個13C 原子，其中n=代謝物中碳原子的數(shù)量。對于每個代謝物，使用MSDChem 軟件分析含有母分子中所有碳原子的信息碎片離子，整合從m+0 到m+n的所有質(zhì)量同位素的豐度，其中m=沒有任何13C 的碎片離子的質(zhì)量。然后對每個質(zhì)量同位素的豐度進(jìn)行數(shù)學(xué)校正，以考慮到自然豐度同位素，最后轉(zhuǎn)化為總庫的百分比。

1.2.6 細(xì)胞耗氧量的測定代謝測量是在標(biāo)準(zhǔn)的24 孔Seahorse 微孔板上在Seahorse XF24 分析儀上進(jìn)行的。糖酵解是根據(jù)糖酵解應(yīng)激測試套件測量的，并顯示為細(xì)胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）。當(dāng)細(xì)胞在含有10 mmol/L 丙酮酸鈉作為唯一呼吸底物培養(yǎng)時，使用氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）測量丙酮酸的氧化。對于所有的實(shí)驗(yàn)，在分析前16～18 h，每孔有8 萬個細(xì)胞。

1.2.7 RNA 抽取、miRNA 測序和實(shí)時熒光定量PCR根據(jù)制造商的說明，使用RNeasy Mini Kit 從細(xì)胞中提取和純化總RNA。對于miRNA 測序，純化的總RNA 交由華大基因測序。對于實(shí)時熒光定量PCR，使用高容量cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。隨后，用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix 進(jìn)行實(shí)時PCR。所有反應(yīng)至少進(jìn)行了4 次。

1.2.8 細(xì)胞增殖水平的測定細(xì)胞增殖是通過在96 孔板中每孔分選5 000 個單細(xì)胞進(jìn)行的。3 d 內(nèi)每24 h 抽吸1 次培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，然后儲存在-80 °C，收獲平板。使用CyQuant 細(xì)胞增殖測定試劑盒測定增殖，使用Varioskan Flash 讀片機(jī)測定熒光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad 5.0 軟件，通過單因素方差分析或t檢驗(yàn)來分析各組之間的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-520c-3p表達(dá)對結(jié)直癌干細(xì)胞增殖的影響

過表達(dá)或敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT-116、HT-29、SW-1116） 的增殖水平均無明顯變化（均P＞0.05）。過表達(dá)miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞 （HCT-116CSC、 HT-29CSC、 SW-1116CSC）的增殖水平均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05）；敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞HCT-116CSC、HT-29CSC、SW-1116CSC 的增殖水平明顯降低（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 miR-520c-3p表達(dá)對結(jié)直腸癌干細(xì)胞丙酮酸代謝的影響

過表達(dá)或敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的丙酮酸氧化水平均無明顯變化（均P＞0.05）。過表達(dá)miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的丙酮酸氧化水平均明顯下降（均P＜0.05）；敲低miR-520c-3p后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的丙酮酸氧化水平均明顯上升（均P＜0.05）（圖2A）。用D-（U-13C）葡萄糖培養(yǎng)后，未標(biāo)記的檸檬酸鹽（m+0）在敲低miR-520c-3p的結(jié)直腸癌干細(xì)胞中均明顯減少（均P＜0.05），而高階檸檬酸鹽標(biāo)記（m+1、m+4 和m+5）均明顯增加（均P＜0.05）；未標(biāo)記的檸檬酸鹽（m+0）在過表達(dá)miR-520c-3p 的結(jié)直腸癌干細(xì)胞中均明顯增加（均P＜0.05），而高階檸檬酸鹽標(biāo)記（m+1、m+4 和m+5） 均明顯減少（均P＜0.05）（圖2B-D）。過表達(dá)miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸均明顯增高（均P＜0.05）；敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸均影響減少（均P＜0.05）（圖2E-G）。

2.3 miR-520c-3p的靶基因分析與鑒定

過表達(dá)或敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞SW-1116CSC 中多種基因的轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控，經(jīng)過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p 可以與線粒體丙酮酸載體1（mitochondrial pyruvate carrier 1，MPC1）mRNA 3'UTR 相結(jié)合（圖3A-B）。熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p 可以靶向MPC1 mRNA 3'UTR （P＜0.05）（圖3C）。過表達(dá)miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞中MPC1 的mRNA 和蛋白水平均明顯下降（均P＜0.05）；敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞中MPC1 的mRNA 和蛋白水平均明顯上升（均P＜0.05）（圖3D-E）。同時，TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集COAD 和COADREAD 中低表達(dá)MPC1 的結(jié)直腸癌患者有較差的預(yù)后（P＜0.05）（圖3F）。敲低MPC1 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的丙酮酸氧化水平均明顯下降（均P＜0.05），而同時敲低miR-520c-3p和MPC1 后結(jié)直腸癌干細(xì)胞丙酮酸氧化水平均無明顯變化（均P＞0.05）（圖3G）。用D-（U-13C）葡萄糖培養(yǎng)后，未標(biāo)記的檸檬酸鹽（m+0） 在敲低MPC1 的結(jié)直腸癌干細(xì)胞中均明顯增加（均P＜0.05），而高階檸檬酸鹽標(biāo)記（m+1、m+4 和m+5）均明顯減少（均P＜0.05）（圖3H-J）。敲低MPC1 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸均明顯增高均（P＜0.05），而同時敲低miR-520c-3p 和MPC1 后結(jié)直腸癌干細(xì)胞的乳酸水平無明顯變化（均P＜0.05）（圖3K-M）。敲低MPC1 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞產(chǎn)生的增殖能力均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05），而同時敲低miR-520c-3p 和MPC1 后結(jié)直腸癌干細(xì)胞的增殖水平無明顯變化（均P＞0.05）（圖3N-P）。

圖3 miR-520c-3p 靶向MPC1 調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞丙酮酸代謝 A：過表達(dá)或敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞SW-1116CSC的轉(zhuǎn)錄組熱圖；B：生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-520c-3p與MPC1 mRNA 3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)；C：熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測miR-520c-3p 與MPC1 mRNA 3'UTR 的結(jié)合；D-E：過表達(dá)或敲低miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌細(xì)胞中MPC1 的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平；F：MPC1不同表達(dá)水平對結(jié)直腸癌生存曲線的影響；G：圖中所示處理下，結(jié)直腸癌細(xì)胞以及結(jié)直腸癌干細(xì)胞的丙酮酸氧化水平；H-J：各種處理下，D-（U-13C）葡萄糖培養(yǎng)后質(zhì)量同位素分析檸檬酸鹽（m+0、m+1、m+2、m+3、m+4、m+5、m+6）；K-M：各種處理下，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的乳酸和葡萄糖水平；N-P：各種處理下，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的增殖水平Figure 3 MiR-520c-3p regulating pyruvate metabolism of colorectal cancer stem cells by targeting MPC1 A:Heatmap of transcriptome analysis in SW-1116CSC colorectal cancer stem cells with overexpression or knockdown of miR-520c-3p;B:Prediction of binding sites between miR-520c-3p and MPC1 mRNA 3'UTR using bioinformatics software;C:Luciferase reporter assay to detect the binding of miR-520c-3p to MPC1 mRNA 3'UTR;D-E:The mRNA and protein expression levels of MPC1 in colorectal cancer cells after overexpression or knockdown of miR-520c-3p;F:Ⅰmpact of different expression levels of MPC1 on survival curve of colorectal cancer;G:Pyruvate oxidation levels in colorectal cancer cells and colorectal cancer stem cells under various treatments;H-J:Mass isotopomer analysis of citrate(m+0,m+1,m+2,m+3,m+4,m+5,m+6)after D-(U-13C)glucose culture in different treatments;K-M:Lactate and glucose levels in colorectal cancer stem cells under various treatments;N-P:Proliferation levels of colorectal cancer stem cells under various treatments

3 討論

在全世界的癌癥發(fā)病率和病死率排名中，結(jié)直腸癌分別位列第三和第四[17-20]。每年有超過100 萬的結(jié)直腸癌新病例，大約有70 萬例死于該病[21]。多種因素參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，包括致癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活[22-24]。清楚地了解結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、遷移和復(fù)發(fā)的機(jī)制，將大大有助于結(jié)直腸癌的早期診斷和治療。本研究通過前期TCGA 數(shù)據(jù)集分析與后期功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-520c-3p/MPC1 軸調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的丙酮酸代謝水平。

大多數(shù)分化的細(xì)胞通過糖酵解在細(xì)胞液中把葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后在線粒體中進(jìn)行丙酮酸氧化[25]。相反，增殖型細(xì)胞，包括許多腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞，有力地進(jìn)行糖酵解，但限制了線粒體丙酮酸氧化的比例[26]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的增殖水平顯著上升、丙酮酸氧化水平顯著下降、乳酸顯著增高。用D- （U-13C）葡萄糖培養(yǎng)后，未標(biāo)記的檸檬酸鹽（m+0）在過表達(dá)miR-520c-3p 的結(jié)直腸癌干細(xì)胞中增多，而高階檸檬酸鹽標(biāo)記（m+1、m+4 和m+5）減少。含有高階標(biāo)記的檸檬酸鹽是由于葡萄糖衍生的丙酮酸轉(zhuǎn)移到線粒體，然后丙酮酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶和三羧酸循環(huán)的活動而產(chǎn)生的。在較短的標(biāo)記時間內(nèi)，標(biāo)記的差異更為明顯，然而，m+0 檸檬酸鹽的增多表明葡萄糖對TCA 循環(huán)的貢獻(xiàn)率減少。由于檸檬酸鹽中13C 的積累導(dǎo)致m+1、m+4 和m+5 的豐度增加，m+0 檸檬酸鹽隨著miR-520c-3p 通量的增加而明顯增加，但m+2 和m+6 檸檬酸鹽的豐度變化非常小。這些數(shù)據(jù)表明，miR-520c-3p 表達(dá)減少了丙酮酸通量進(jìn)入線粒體，減少了丙酮酸氧化，減少了三羧酸循環(huán)中乙酰輔酶A 的水平。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p 可以靶向MPC1 mRNA 3'UTR。過表達(dá)miR-520c-3p 后，結(jié)直腸癌干細(xì)胞中MPC1 的mRNA 水平和蛋白水平顯著下降。同時，本研究的數(shù)據(jù)顯示，敲低MPC1 的結(jié)直腸癌干細(xì)胞中線粒體代謝發(fā)生了改變，增加了細(xì)胞內(nèi)丙酮酸和乳酸的數(shù)量。MPC1 是一種將丙酮酸轉(zhuǎn)移到線粒體的內(nèi)膜蛋白，抑制MPC1 的表達(dá)會使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和谷氨酸溶解[27]。谷氨酰胺分解的增加是由于旁路機(jī)制補(bǔ)償了線粒體中丙酮酸的損失，并通過谷氨酰胺流入維持三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的補(bǔ)充[28]。盡管丙酮酸被認(rèn)為是一種抗氧化分子，但由于丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸并外流到細(xì)胞外空間，可能無法有效發(fā)揮作用[29]。此外，通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族7 成員 11 （solute carrier family 7 member 11，SLC7A11，也稱xCT） 消耗谷胱甘肽（glutathione，GSH）也會增加線粒體的代謝，從而導(dǎo)致MPC1 沉默的癌細(xì)胞的鐵中毒敏感性增加[30]。因此，抑制MPC1 的表達(dá)會改變結(jié)直腸干細(xì)胞中丙酮酸代謝。

綜上所述，結(jié)直腸癌中高表達(dá)的miR-520c-3p與較差的預(yù)后相關(guān)，其作用機(jī)制可能與miR-520c-3p靶向MPC1 調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的丙酮酸代謝水平，促進(jìn)了結(jié)直腸癌干細(xì)胞的增殖有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙英旋負(fù)責(zé)科研設(shè)計、數(shù)據(jù)分析；白玉勤負(fù)責(zé)病例收集、文章寫作修改；歐陽衛(wèi)東負(fù)責(zé)指導(dǎo)以及文章修改。