circRAD18/miR-516b/PDK1軸調節(jié)葡萄糖代謝重編程與結直腸癌增殖的關系

李威，唐云云，彭娟，蔣訓歸

（1.湖南省永州市中心醫(yī)院 肛腸疝外科，湖南 永州 425006；2.永州職業(yè)技術學院 公共基礎學部，湖南 永州 425100）

結直腸癌為消化道常見的惡性腫瘤之一[1]，2020年全球結直腸癌新發(fā)病例數(shù)量超過193 萬例，占全球新確診惡性腫瘤例數(shù)的9.7%，約占全球癌癥死亡病例的9.4%[2]。研究[3-4]顯示，早期結直腸癌患者5年生存率可達90%，但晚期患者的中位生存期往往不足2年。因此結直腸癌患者的早期診斷及治療就顯得格外重要，近年來各種特異度強、敏感度高及侵襲性低的非編碼RNA 生物標志物被發(fā)現(xiàn)并運用于臨床[5]，該類生物標志物的功能研究及運用將對結直腸癌的臨床診治具有重要意義。

非編碼RNA 是一類重要的癌癥生物學調節(jié)因子，其中環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞內非編碼RNA[6]。circRNA無3'-頭或5'-尾的結構，該類環(huán)狀結構在多種人類細胞中大量存在，其具有數(shù)十萬個堿基，且可通過多種機制調控或改變多種重要基因的功能及表達，包括與蛋白質結合、 阻斷微小RNA（microRNA，miRNA），甚至編碼低分子量蛋白質等[7]。隨著現(xiàn)今circRNA 測序技術和生物信息學方法的發(fā)展，越來越多的circRNA 被發(fā)現(xiàn)[8]。研究[9-10]顯示circRAD18 可促進三陰性乳腺癌的增殖、通過多條生物軸調控乳腺癌的進展，也可促進甲狀腺乳頭狀癌的惡性進展。目前circRAD18 在結直腸癌中的功能及可能的生物學作用尚無報道。筆者前期通過circinteractome 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測circRAD18 與miR-516b 存在結合位點，而丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase 1，PDK1）可能是miR-516b 的靶基因。本研究以上述研究背景為基礎，初步探討circRAD18 在結直腸癌細胞中的表達及作用，及其對靶miR-516b 及PDK1 的調控關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Lipofectamine 3000 轉染試劑、 TRIzol 試劑、RIPA 裂解液、PMSF （Thermo，美國，L3000001、15596026、89901、36978），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素（Gibco，美國，11965092、10100147、15140122），PDK1 和β-actin 抗體（Abcam，美國，ab202468、 ab8226），Anti-Ago2 抗體（Millipore，USA，03-110），RNA 抽提試劑盒 （Applied Biosystems，USA，AM1835）、TaqMan 逆轉錄試劑盒（4366597）、 qSYBR-Green-containing PCR 試劑盒（4349182），RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒（Millipore，USA，17-371），雙熒光素酶活性檢測試劑盒（Qiagen，USA，59934），葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測試劑盒Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit（Invitrogen，USA，A22189）、乳酸檢測試劑盒（Sigma，美國，MAK065），血細胞計數(shù)板（16×25 格），紫外可見分光光度計（Thermo，Nanodrop 2000，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)結直腸癌細胞SW480、SW620、HT-29 及正常結直腸上皮細胞NCM460 （ATCC 來源）均根據(jù)供應商提供的說明書培養(yǎng)于含10% FBS的培養(yǎng)基中。所有細胞均置于37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內孵育。miR-516b 模擬物及其對照miR-CTR、circRAD18 敲除siRNA（si-circRAD18）及其對照（si-circCON）均由美國的Invitrogen 公司設計、構建及合成。突變型circRAD18-wt、PDK1-wt及野生型circRAD18-mut、PDK1-mut 的熒光素酶報告基因載體均由GeneCopoeia 公司構建。

1.2.2 circRAD18 敲除及質粒轉染收集細胞，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液稀釋，吹打制成104/mL的細胞懸液，6 孔板中每孔鋪2 mL 細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中。細胞匯合度約60%～80%時準備轉染，用無菌EP 管配制lipofectamin 3000 和轉染試劑；兩者混勻并室溫放置20 min。將上述混合物加入到無血清培養(yǎng)液（不含抗生素）中混勻，加入到待轉染的6 孔中；置于培養(yǎng)箱中，6 h 后換成常規(guī)培養(yǎng)基。48 h 后，收集細胞并抽提蛋白或進行其他實驗。si-circRAD18 序列為：5'-AAU CAG ACU GCU CUC UCU GUA-3'；其對照序列si-circCON 為：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'。

1.2.3 RNA 提取和qRT-PCR 檢測TRIzol 裂解液、氯仿、1∶2 的異丙醇-TRIzol、75%乙醇及4 ℃離心機用于細胞及組織的RNA 提取，提取的RNA 在紫外可見分光光度計上檢測合格后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉募毎蚪M織總RNA 為模板，按逆轉錄試劑盒說明書及qSYBR-Green-containing PCR 試劑盒的說明書進行操作，進行相對定量（BioRad IQTM5 Multicolor 實時熒光定量系統(tǒng)，美國）。其中miR-516b 引物由Invitrogen 公司合成，U6 為內參，2-ΔΔCT用于相對表達量的計算，其中ΔΔCT=（CTmiRNA-CTU6）靶基因-（CTmiRNA-CTU6）對照。反應體系為20 μL，每組實驗設置3 個復孔。circRAD18 的引物堿基序列正向：5'-CAG CTC ATT AAA AGG CAC CA-3'，反向：5'-CAC ACA GCA AGT TGG ACA CTG-3'；內參U6 的引物序列正向：5'-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3'，反向：5'-CAC TAT TGC GGG TCT GC-3'。

1.2.4 CCK-8 細胞增殖將結直腸癌細胞經(jīng)0.25%的胰酶消化后，將si-circRAD18 （細胞密度調至5×103/mL） 和si-circCON 細胞（細胞密度調至5×103/mL）置于96 孔板中。將培養(yǎng)板在37 ℃下孵育一定時間，然后加入CCK-8 溶液（10 μL），于450 nm 波長下檢測吸光度值。

1.2.5 葡萄糖消耗和乳酸含量的測量將細胞接種到12 孔板中，每孔接種3×105個細胞。24 h 后收集培養(yǎng)基，并儲存在-20 C°備用，直到進行測定。分別根據(jù)葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測試劑盒Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit 和乳酸檢測試劑盒的說明書進行操作，檢測結直腸癌細胞HT-29中上清液中葡萄糖的消耗量及乳酸的產(chǎn)生量。分別檢測563 nm 及460 nm 波長處的吸光度值，并將結果標準化為與對照細胞相比的總蛋白量。

1.2.6 熒光素酶活性檢測驗證miR-516b 與circRAD18 結合的熒光素酶實驗分為4 組，分別為：miR-516b 與circRAD18-wt、miR-CTR 與circRAD18-wt、miR-516b 與circRAD18-mut、miR-CTR 與circRAD18-mut；驗證miR-516b 與PDK1 結合的熒光素酶實驗也分為4 組，miR-516b 與PDK1-wt、miR-CTR 與PDK1-wt、miR-516b 與PDK1-mut、miR-CTR 與PDK1-mut。按上述分組分別轉染HT-29 細胞，48 h 后收集細胞。根據(jù)試劑商提供的試劑盒說明書進行操作。相對熒光素酶活性為熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值，每組實驗設置3 個復孔（Biorad 單光子檢測儀，美國），驗證circRAD18 與miR-516b 及miR-516b 與PDK1 之間的結合關系。

1.2.7 RNA 免疫沉淀（RIP）在RIP 分析之前，先使 用 MS2bs-circRAD18、 MS2bs-circRAD18-mt 和MS2bs-Rluc（對照載體）轉染結直腸癌細胞。RIP實驗根據(jù)RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒、anti-Ago2抗體的說明書進行操作，miR-516b 需富集純化后檢測。也被使用，PDK1 mRNA、circRAD18 和miR-516b 均采用相對定量。

1.2.8 Western blot 分析從HT-29 細胞中分離蛋白質（RIPA 裂解液、PMSF），收集蛋白，用于SDSPAGE 凝膠分離。蛋白質在300 mA 條件下進行轉膜，2 h 后將膜轉移至4 ℃冰箱，并用PDK1 抗體處理過夜，次日于室溫下使用特異性二抗孵育1 h。其中PDK1 和β-actin 抗體的使用濃度為1∶1 000。

1.3 統(tǒng)計學處理

SPSS 20.0 軟件用于數(shù)據(jù)的記錄與分析。實驗結果采用計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，t檢驗用于組間數(shù)據(jù)比較，單因素方差分析用于多組間數(shù)據(jù)比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circRAD18在結直腸癌中的表達及功能

采用qRT-PCR 檢測結直腸癌及正常結直腸上皮細胞中circRAD18 的表達水平，結果顯示，相對正常結直腸上皮細胞NCM460，circRAD18 在結直腸癌細胞系中的表達均明顯上調（均P＜0.05）（圖1A）。為進一步探究circRAD18 對結直腸癌細胞生長及代謝的影響，使用靶向circRAD18 的siRNA 來敲低結直腸癌細胞中circRAD18 的表達。si-circRAD18 的敲低效率在HT-29 結直腸癌細胞系中得到驗證（圖1B）。CCK-8 增殖檢測實驗顯示circRAD18 的下調抑制結直腸癌細胞的增殖能力（圖1C）。另外通過檢測葡萄糖攝取量和乳酸產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)circRAD18 的沉默可以明顯抑制結直腸癌中的細胞葡萄糖攝取及乳酸產(chǎn)生，且其對正常結直腸上皮細胞NCM460 則沒有影響（P＞0.05）（圖1D-E）。

圖1 circRAD18在結直腸癌中的表達及功能 A：circRAD18在結直腸癌細胞系中的相對表達；B：轉染si-circRAD18后的沉默效能分析；C：CCK-8檢測細胞增殖；D：細胞葡萄糖攝取量檢測；E：細胞乳酸產(chǎn)生量檢測Figure 1 Expression and function of circRAD18 in colorectal cancer A:Relative expression of circRAD18 in colorectal cancer cell lines;B:Analysis of silencing efficiency after transfection with si-circRAD18;C:Cell proliferation assessment using CCK-8 assay;D:Measurement of cellular glucose uptake;E:Measurement of cellular lactate production

2.2 結直腸癌中circRAD18對miR-516b的作用

在分離結直腸癌細胞HT-29 的細胞質和細胞核部分后，通過qPCR 檢測明確了circRAD18 的亞細胞定位。結果顯示circRAD18 主要存在于結直腸癌細胞的胞質中，也是miRNA 所處的主要位置，表明兩者之間存在相互作用（圖2A）。根據(jù)生物信息學軟件預測，circRAD18 序列上可能存在2 個與miR-516b 結合的位點（圖2B）。通過雙熒光素酶報告基因實驗證實circRAD18 能夠與miR-516b 相互作用（圖2C）。隨后為進一步驗證，進行了MS2 相關的RIP 實驗以驗證circRAD18 和miR-516b 之間的直接相互作用關系，結果顯示miR-516b 在MS2bscircRAD18 組明顯富集（圖2D）。

圖2 circRAD18 與miR-516b 的關系 A：細胞不同部位中circRAD18、RAD18 mRNA、GAPDH 和18S 的相對比例；B：circRAD18序列中miR-516b的預測結合位點；C：雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-516b模擬物和circRAD18之間的相互作用；D：MS2相關的RⅠP實驗驗證結合關系Figure 2 Relationship between circRAD18 and miR-516b A:Relative proportions of circRAD18,RAD18 mRNA,GAPDH,and 18S in different cellular compartments;B:Predicted binding sites of miR-516b in the circRAD18 sequence;C:Dualluciferase reporter gene assay to investigate the interaction between miR-516b mimic and circRAD18;D:MS2-related RⅠP experiment to validate the binding relationship

2.3 circRAD18對下游PDK1的調節(jié)作用

TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測PDK1 是miR-516b 的下游靶基因（圖3A）。PDK1 是葡萄糖攝取過程中的一種代謝蛋白，多項研究證實其為一種癌基因，并在多種惡性腫瘤中存在過度表達，對癌癥進展至關重要。熒光素酶報告基因實驗證實miR-516b 能夠直接結合PDK1 mRNA 的3'-UTR （圖3B）。轉染miR-516b 模擬物后，結直腸癌細胞HT-29 中PDK1的相對表達量明顯降低（圖3C），對AGO2 蛋白相關的RISC 復合物進行RIP 檢測，結果顯示circRAD18、PDK1 和miR-516b 均聚集在抗Anti-Ago2組中（圖3D）。circRAD18 沉默可導致PDK1 向的RISC 聚集明顯增加（圖3E）。

圖3 miR-516b與PDK1的關系及circRAD18的調節(jié)作用 A：TargetScan數(shù)據(jù)庫預測PDK1與miR-516b相互作用的mRNA 3'-UTR序列；B：雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-516b模擬物和PDK1之間的相互作用；C：qRT-PCR分析miR-516b對PDK1的作用；D：circRAD18、PDK1和miR-516b在Ago2上的聚集；E：circRAD18沉默后，circRAD18與Ago2結合的豐度降低，而PDK1增加Figure 3 Relationship between miR-516b and PDK1 and the regulatory role of circRAD18 A:TargetScan database prediction of mRNA 3'-UTR sequences for the interaction between PDK1 and miR-516b;B:Dual-luciferase reporter gene assay to validate the interaction between miR-516b mimic and PDK1;C:qRT-PCR analysis of the effect of miR-516b on PDK1;D:Aggregation of circRAD18,PDK1,and miR-516b on Ago2;E:Decreased abundance of circRAD18 binding to Ago2 and increased PDK1 after circRAD18 silencing

2.4 circRAD18-miR-516b-PDK1 軸對結直腸癌代謝重編程的影響

通過檢測葡萄糖攝取量和乳酸產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)用miR-516b 模擬物及si-circRAD18 轉染結直腸癌HT-29 細胞，可明顯降低細胞葡萄糖的攝取率及乳酸產(chǎn)生量，且這種降低均可被PDK1 的補充所逆轉（均P＜0.05）（圖4A-B）。另外，miR-516b 模擬物或si-circRAD18 的引入可以明顯降低PDK1 的蛋白表達，且該過程可通過補充PDK1 蛋白來逆轉（均P＜0.05）（圖4C）。

圖4 circRAD18-miR-516b-PDK1 軸在直腸癌細胞中的作用 A：miR-516b 模擬物及si-circRAD18 的轉染可抑制細胞葡萄糖攝取，PDK1 過表達后，葡萄糖攝取水平可恢復；B：miR-516b 模擬物及si-circRAD18 的轉染可抑制細胞乳酸產(chǎn)生，PDK1 過表達后，乳酸產(chǎn)生水平可恢復；C：miR-516b 模擬物及si-circRAD18 的引入可以降低PDK1 的蛋白表達，補充PDK1可逆轉Figure 4 The role of the circRAD18-miR-516b-PDK1 axis in colorectal cancer cells A:Transfection with miR-516b mimic and si-circRAD18 can inhibit cellular glucose uptake,and the overexpression of PDK1 can restore glucose uptake levels;B:Transfection with miR-516b mimic and si-circRAD18 can inhibit cellular lactate production,and the overexpression of PDK1 can restore lactate production levels;C:Ⅰntroduction of miR-516b mimic and si-circRAD18 can reduce the protein expression of PDK1,and supplementation with PDK1 can reverse this effect

3 討論

隨著高通量測序等多種生物信息學前沿技術的不斷發(fā)展，越來越多的circRNA 被發(fā)現(xiàn)，并被深入研究[11]。研究[12-13]顯示，5.8%～23%的具有轉錄活性的人類基因可產(chǎn)生circRNA，且這些circRNA在不同的組織及細胞類型間可保持動態(tài)平衡。circRNA 在哺乳動物中表達是高度保守的，其環(huán)狀結構使其對RNase R 具有抗性，且結構比相應的線性RNA 要更穩(wěn)定[14]。circRNA 可作為miRNA 海綿發(fā)揮調節(jié)功能，circRNA 具有miRNA 的結合位點，常作為miRNA 的活性調節(jié)者參與多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展；circRNA 可與RBPs 相互作用，其通過結合、儲存或隔離RBP 到特定的亞細胞位置從而發(fā)揮作用；circRNA 也可發(fā)揮轉錄和選擇性剪接的調節(jié)的功能，其位于核內的circRAN 及外顯子-內含子環(huán)狀RNA （Exon-intron circular RNA，ElciRNA） 可在轉錄水平發(fā)揮功能；另外circRNA 也可以直接發(fā)揮翻譯功能，部分circRNA 具有直接編碼蛋白的能力，可翻譯蛋白[15-18]。研究顯示，circRNA 在血液及其他體液中均具有較高的穩(wěn)定性，因此circRNA也是多種疾病診斷的潛在生物標志物。

研究[18]顯示，circAGO2 可通過促進RISC HUR而促進多種癌癥的進展。circ133 及circHIPK3 是結直腸癌中的重要調控因子[19-20]。circITCH 被證實是癌癥中的腫瘤抑制因子[21]，circFAM120A 被證實可通過抑制FAM120A 與IGF2BP2 的結合而促進細胞的增殖[22]。但迄今為止，關于circRNA 在結直腸癌中作用和功能的研究較少，關于circRAD18 在結直腸癌中的研究目前未見報道。研究顯示，circRAD18 在乳腺癌中高表達且敲除circRAD18 可抑制乳腺癌的進展，該過程可能是通過調節(jié)miR-613/HK2 軸來實現(xiàn)的[23]，circRAD18 也可通過海綿吸附miR-208a/3164 調節(jié)IGF1 和FGF2 的表達來促進三陰性乳腺癌進展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)circRAD18 在結直腸組織及細胞系中表達上調，且敲除circRAD18 顯著抑制結直腸癌細胞的生長能力，該結果與上述乳腺癌中circRAD18 高表達及對腫瘤的促進作用一致。研究顯示circRAD18 還可促進急性髓系白血病細胞的增殖、遷移和侵襲過程，并抑制細胞凋亡和細胞周期停滯，在急性髓系白血病中扮演癌基因的結果[23]，另外circRAD18 也可促進甲狀腺乳頭狀癌的生長和轉移能力[10]，說明circRAD18 可在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。

雙熒光素酶報告基因實驗及RIP 實驗驗證證實circRAD18 可與miR-516b 結合，而PDK1 是miR-516b的下游靶基因。即circRAD18-miR-516b-PDK1 軸在結直腸癌的進展中發(fā)揮重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)circRAD18 參與了結直腸癌的葡萄糖代謝重編程過程，circRAD1 的沉默顯著抑制結直腸癌細胞的細胞葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生，表明circRAD18 可直接阻斷其下游的miR-516b，促進結直腸癌細胞通過刺激葡萄糖代謝蛋白PDK1 的表達而促進結直腸癌的進展。上述結果與已有研究[10]上調的circRAD18 通過甲狀腺乳頭狀癌的葡萄糖代謝重編程促進腫瘤的進展相一致。

研究顯示，miR-516b 是重要的腫瘤抑制因子，其在骨肉瘤中表達下調[25]，在神經(jīng)膠質瘤中，circCDC45 的表達顯著上調，其可通過阻斷miR-516b 而促進膠質瘤細胞的增殖和轉移[26]。另外長鏈非編碼RNA Linc-01123 可通過miR-516b-5p/Gli1 軸調控Hedgehog 通路而影響骨肉瘤的進程[27]。在天然產(chǎn)物和傳統(tǒng)中藥提取物相關的研究中，作為一個已經(jīng)被證實的miR-516b 靶標，PDK1 被報道可調節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝以及體內平衡[28]。而PDK1 也被證實可促進黑色素瘤細胞的有氧糖酵解和增殖[29]。根據(jù)本研究的研究結果，PDK1 被證實是miR-516b 在結直腸癌中的下游靶基因，且circRAD18 可以增強PDK1 的蛋白表達水平。

綜上，本研究探討了circRAD18 在結直腸癌生長及葡萄糖代謝中的功能，并揭示了circRAD18/miR-516b/PDK1 軸在結直腸癌代謝重編程中的功能的分子機制，本研究可能對開發(fā)結直腸癌新的生物標志物及治療策略具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李威、蔣訓歸負責構思與設計；彭娟負責提供研究材料或患者；李威、唐云云負責數(shù)據(jù)收集和處理；李威、彭娟負責數(shù)據(jù)分析和解釋；李威負責手稿寫作；所有作者均審核并批準手稿。