蜂蠟含量對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體消化釋放行為及巨噬細(xì)胞攝取率的調(diào)控影響

田文妮，宋增柳，楊 淥，肖 杰,2,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLCs）是由脂質(zhì)基質(zhì)（室溫下固體脂和液體油組成的混合脂質(zhì)相）在表面活性劑作用下形成的乳液膠體分散體系[1]。相比于固體脂質(zhì)納米顆粒（油相由室溫下為固態(tài)的固體脂組成）或納米乳液（油相由液體油組成），NLC脂質(zhì)相中固體脂與液體油同時(shí)存在，具有不完美的晶體結(jié)構(gòu)，這種無(wú)序缺陷型晶格結(jié)構(gòu)為無(wú)定形狀態(tài)或非晶簇形態(tài)的功能組分提供更多負(fù)載空間，不僅可提高負(fù)載量和包封效率，而且能夠減少儲(chǔ)存過(guò)程中功能組分的析出滲漏，體現(xiàn)出更高的膠體穩(wěn)定性[2-3]。此外，NLC具有可控的流變行為、消化緩釋特性、生物膜親和性、組織黏液滲透性和上皮細(xì)胞吸收率。這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)對(duì)提高活性物質(zhì)的生物利用度和健康功效具有重要作用[4-5]。

姜黃素具有抗炎、抗腫瘤等生物功效，可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞中抗炎因子的分泌而發(fā)揮抗炎活性[6]。然而，姜黃素溶解度和生物可及性低，在炎癥部位（巨噬細(xì)胞）吸收效率低，極易排出體外[7-10]。這些因素限制了姜黃素抗炎活性的發(fā)揮。通過(guò)構(gòu)建NLC負(fù)載遞送體系，提高姜黃素在胃腸道中的分散性，增強(qiáng)其在炎癥部位的時(shí)滯性和黏液滲透性，是一種可行的策略[11-12]。研究表明，脂質(zhì)相組成（如固體脂種類(lèi)和固體脂比例）是影響NLC制備和物理特性的重要因素[13]。不同熔點(diǎn)的固體脂質(zhì)（如蜂蠟、棕櫚蠟、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸）可通過(guò)影響NLC中結(jié)晶的形成和分布行為進(jìn)而調(diào)控其包封效率和穩(wěn)定性[14-15]。蜂蠟是一種由正烷烴、酯類(lèi)、脂肪酸和脂肪醇（碳鏈長(zhǎng)為18）組成的固體脂質(zhì)（熔點(diǎn)65 ℃），可在室溫下自組裝形成晶體；將蜂蠟與液體油（如中鏈脂肪酸、大豆油）加熱混合后冷卻，可獲得結(jié)構(gòu)化的脂質(zhì)相[15]。作為天然的可食性固體脂，蜂蠟在構(gòu)建脂質(zhì)基乳液（如NLC、固體脂質(zhì)載體）、凝膠（如乳液凝膠、油凝膠）等遞送載體的應(yīng)用中具有廣闊的前景[16]。此外，固體脂占脂質(zhì)相的比例也是影響NLC結(jié)構(gòu)性能和理化特性的關(guān)鍵因素，Solemanian等[16]從晶體結(jié)構(gòu)角度揭示了蜂蠟（固體脂質(zhì)）與石榴籽油的質(zhì)量比對(duì)NLC粒徑、Zeta電位和穩(wěn)定性的影響。Alotaibi等[17]發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控油酸（液體脂質(zhì)）和月桂酸（固體脂質(zhì)）的質(zhì)量比可顯著調(diào)控NLC的結(jié)構(gòu)特性、包封率、負(fù)載率、釋放行為和生物利用度。綜上，以固體脂占脂質(zhì)相的比例為調(diào)控切入點(diǎn)開(kāi)展其對(duì)NLC結(jié)構(gòu)特性、消化釋放行為及巨噬細(xì)胞攝取的調(diào)控研究對(duì)提高親脂活性成分姜黃素抗炎活性具有重要指導(dǎo)意義。

本研究采用高速乳化-探頭超聲法制備不同蜂蠟含量的負(fù)載姜黃素的NLCs?；趯?duì)不同蜂蠟含量NLCs的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、封裝效率和剪切流變行為的研究，揭示脂質(zhì)相中蜂蠟含量對(duì)NLCs微觀形貌、粒徑電位、負(fù)載率、包封率、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和表觀黏度的調(diào)控規(guī)律?；隗w外黏液黏附和模擬消化實(shí)驗(yàn)，闡釋脂質(zhì)相中蜂蠟含量通過(guò)調(diào)控NLCs結(jié)構(gòu)和流變特性對(duì)負(fù)載姜黃素的NLCs在小腸的黏液黏附滲透行為、脂質(zhì)消化和姜黃素釋放行為的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

RAW264.7細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；SPF級(jí)7 周齡SD大鼠 湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2022-0136。

吐溫80（Tween 80）、蜂蠟（由碳鏈長(zhǎng)為30的正烷烴、碳鏈長(zhǎng)為35的長(zhǎng)鏈脂肪酸酯、碳鏈長(zhǎng)為18的脂肪酸和脂肪醇組成）、中鏈脂肪酸甘油三酯（medium-chain triglycerides，MCT）、姜黃素（純度＞98.0%） 上海源葉生物科技有限公司；4%福爾馬林、無(wú)水乙醇（均為試劑純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；青霉素、鏈霉素、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）細(xì)胞培養(yǎng)基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染劑 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN超聲波破碎儀 寧波信智生物科技有限公司；PT 2500 E高速剪切機(jī) 瑞士Kinematica公司；KDC-120HR高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FEI/Talos L120C透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM） 美國(guó)FEI公司；Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡 德國(guó)Carl Zeiss公司；Zetasizer Nano-ZS 90激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司；Synergy LX多功能酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；KAAKE MARS流變儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；動(dòng)物活體可見(jiàn)光成像系統(tǒng)IVIS Lumina CT III成像設(shè)備 美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NLC的制備

以MCT及蜂蠟為混合油相，固定脂質(zhì)相在乳液體系中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，吐溫80質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，調(diào)控蜂蠟在脂質(zhì)相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、5%、10%，采用高速乳化-探頭超聲法制備N(xiāo)LC[12]，分別將樣品命名為NLC0、NLC5和NLC10。具體操作步驟如下：MCT和蜂蠟在75 ℃下混合并熔化，形成均一的混合油相，將模式活性物（姜黃素）按質(zhì)量比1∶60添加到混合油相中，磁力攪拌（轉(zhuǎn)速600 r/min，時(shí)間5 min）混合均勻。按比例逐滴加入質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的吐溫80雙重蒸餾水溶液（75 ℃）。將水相均勻分散于脂相中并使用均質(zhì)器以10 000 r/min進(jìn)行4 min均質(zhì)化以制備乳液。接著，采用超聲波探頭對(duì)制備好的乳液進(jìn)行進(jìn)一步處理，超聲功率65 W，總超聲時(shí)間為12 min，超聲程序采用工作時(shí)間4 s，間歇時(shí)間4 s，超聲完成后迅速置于冰浴中，保持24 h以獲得NLC。

1.3.2 TEM觀察

NLC樣品用雙重蒸餾水稀釋100 倍，放在200 目銅網(wǎng)格上，然后在室溫下風(fēng)干，采用TEM觀察NLC的形貌特征[17]。

1.3.3 粒徑分布和Zeta電位測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）分析NLC的粒徑分布和Zeta電位[18]。用雙重蒸餾水將NLC樣品稀釋10 倍，使用Zetasizer Nano-ZS 90激光粒度儀，在90°的固定散射角下進(jìn)行DLS分析。材料和分散劑的折射率分別為1.450和1.330，溫度設(shè)置為25 ℃。將樣品置于室溫下（25 ℃），監(jiān)測(cè)NLC樣品在4 周內(nèi)的粒徑和Zeta電位，以此來(lái)評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。

1.3.4 負(fù)載率和包封率測(cè)定

精密配制不同質(zhì)量濃度（3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 g/mL）的姜黃素乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以吸光度為縱坐標(biāo)，姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將NLC以15 000 r/min離心30 min后取脂質(zhì)相上清液用無(wú)水乙醇按體積比1∶1進(jìn)行萃取。使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在425 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算上清液中姜黃素的質(zhì)量濃度。姜黃素在NLC的負(fù)載率和包封率分別按公式（1）、（2）計(jì)算[12]。

式中：m姜黃素為負(fù)載姜黃素的NLC中姜黃素的質(zhì)量/g；mi為負(fù)載姜黃素的NLC干燥后的總質(zhì)量/g。

式中：m0是初始姜黃素的總質(zhì)量/g；m游離姜黃素是游離在外水相（上清液）中姜黃素的質(zhì)量/g。

1.3.5 黏度測(cè)定

采用流變儀測(cè)定樣品的剪切黏度特性[19]。在兩個(gè)平行板的幾何測(cè)量單元之間放置大約1 g的NLC樣品，并將間隙的高度設(shè)置為1 mm。樣品在25 ℃下保持2 min，在剪切速率為0～100 s－1的范圍內(nèi)測(cè)定樣品表觀黏度。

1.3.6 離體腸黏附滲透實(shí)驗(yàn)

采用離體腸模型進(jìn)行體外黏附滲透研究[20]。解剖SD大鼠獲取新鮮的小腸，剪成等面積的離體腸切片，將樣品（姜黃素懸液、負(fù)載姜黃素的NLC0、NLC5和NLC10，各組的姜黃素總量為0.8 mg）滴注于離體腸切片上，于37 ℃水浴箱中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗離體腸，用4%福爾馬林固定，DAPI染色后使用IVIS成像設(shè)備成像，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3.7 體外消化實(shí)驗(yàn)

負(fù)載姜黃素的NLC在模擬胃液和模擬腸液中的消化情況參照之前的研究[12]開(kāi)展。NLC在模擬胃液（0.11 mmol/L脫氧膽酸鈉、34.2 mmol/L氯化鈉、2 mg/mL胃蛋白酶和5 mg/mL吐溫80，pH 2.0）中孵育1 h，然后在模擬腸液（3.90 mmol/L牛磺膽酸鈉、19.12 mmol/L馬來(lái)酸、10 mg/mL胰蛋白酶和5 mg/mL吐溫80，pH 7.2）中孵育2 h。采集樣品：NLC在上述模擬體外消化過(guò)程的預(yù)定時(shí)間點(diǎn)（胃模擬消化過(guò)程0、30、60 min；小腸模擬消化過(guò)程0、5、15、30、45、60、90、120 min）取2 mL消化液，并用等量相應(yīng)的模擬液替換。將各時(shí)間點(diǎn)取出的消化液在11 180×g下離心30 min（4 ℃），通過(guò)膜過(guò)濾（0.22 μm濾膜過(guò)濾器）取上清液，并記錄該體積，按V（消化液）∶V（無(wú)水乙醇）＝1∶4混合，利用分光光度計(jì)測(cè)定425 nm波長(zhǎng)處樣品吸光度，以不同質(zhì)量濃度姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程求出樣品中姜黃素的質(zhì)量濃度，從而計(jì)算得到在模擬消化過(guò)程中姜黃素的釋放量。

在模擬腸液中進(jìn)行脂肪分解時(shí)，通過(guò)手動(dòng)添加0.25 mol/L NaOH，使pH值保持在7.20±0.02。采用Excel軟件記錄隨時(shí)間消耗的NaOH體積，計(jì)算脂肪分解產(chǎn)生游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的濃度。FFA的釋放量按公式（3）計(jì)算。

式中：VNaOH是中和產(chǎn)生FFA所需的氫氧化鈉體積/L；cNaOH是所使用的氫氧化鈉溶液的濃度/（mol/L）；mlipid是最初體系中三酰甘油的質(zhì)量/g；Mlipid是三酰甘油的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

采用Gompertz s模型評(píng)估模擬腸道消化前40 min內(nèi)FFA釋放的動(dòng)力學(xué)。FFA的釋放動(dòng)力學(xué)參數(shù)按公式（4）計(jì)算。

式中：K代表FFA在拐點(diǎn)的釋放速率/min－1；C代表FFA的最大釋放量/%；μ代表FFA釋放曲線(xiàn)中的滯后時(shí)間/min；t代表FFA釋放曲線(xiàn)中橫坐標(biāo)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)/min。

1.3.8 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞用高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)10%的磷酸鹽緩沖溶液，100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)[21]。放在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。為了定量負(fù)載姜黃素NLC的攝取量，在24 孔板內(nèi)培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞（細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔）24 h后，將培養(yǎng)液換成pH 7.4的新鮮培養(yǎng)液后用NLC樣品孵育12 h。然后用PBS沖洗細(xì)胞5 次，用體積分?jǐn)?shù)4%的福爾馬林溶液處理2 h，用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)操作，結(jié)果以3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，使用SPSS 22.0軟件中單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重范圍檢驗(yàn)對(duì)P＜0.05的平均值進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蠟含量對(duì)NLC的影響

采用TEM觀察NLC的形貌特征，NLC0、NLC5和NLC10均為近似球體的形貌，分布均一，無(wú)顯著團(tuán)聚現(xiàn)象（圖1A～C）。采用DLS測(cè)定了NLC的粒徑分布，如圖1A～D所示，NLC0、NLC5和NLC10的平均粒徑分別為（170.67±2.08）、（207.33±2.52）nm和（256.00±2.00）nm；多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）分別為0.12±0.02、0.14±0.05、0.15±0.04，表明NLC粒徑隨著脂相中蜂蠟含量的增加而增加。這可能是由于當(dāng)蜂蠟在脂相中的含量較高時(shí)，制備冷卻過(guò)程中脂質(zhì)相中形成的蜂蠟晶體尺寸較大[22]，導(dǎo)致乳液液滴粒徑增大。Zeta電位是表征NLC穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。由圖1E可知，所有NLC的Zeta電位均小于－30 mV，表明其具有良好穩(wěn)定性。隨著蜂蠟在總脂相中的比例增加，NLC的Zeta電位未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），表明蜂蠟含量增加沒(méi)有顯著改變NLC的表面電荷屬性和數(shù)量。

圖1 蜂蠟含量對(duì)NLCs結(jié)構(gòu)特性的影響Fig. 1 Effects of beeswax contents on the structural characteristics of NLCs

NLC包封率和負(fù)載率是衡量其功能活性物遞送效率的重要指標(biāo)之一[23]。以脂溶性活性物姜黃素為活性物模式物，探究蜂蠟在脂相中的比例對(duì)NLC包封率和負(fù)載率的影響。由圖1A～C、E可知，NLC0、NLC5和NLC10對(duì)姜黃素的包封率分別為（87.82±1.32）%、（92.36±1.02）%和（97.27±0.68）%，負(fù)載率分別為（1.45±0.01）%、（1.53±0.03）%和（1.61±0.02）%，表明NLC對(duì)姜黃素具有良好負(fù)載能力和包封效果，且隨著蜂蠟比例增加，其負(fù)載率、包封率均升高。這是由于NLC制備的冷卻過(guò)程中，蜂蠟再結(jié)晶并以α和β型晶體在MCT液體油中呈現(xiàn)無(wú)序分布狀態(tài)，這種不完美晶體結(jié)構(gòu)使NLC的脂質(zhì)相具有更大的空間容納活性物[24]，從而抑制姜黃素外排。此外，蜂蠟含量增大，晶體數(shù)量增大，晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，使得NLC脂質(zhì)基剛性增強(qiáng)[8]，進(jìn)一步阻止姜黃素滲漏，提高了姜黃素包封率和負(fù)載率。

2.2 蜂蠟含量對(duì)NLC儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響

良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是NLC實(shí)現(xiàn)功能活性物質(zhì)遞送的前提[25]。本研究監(jiān)測(cè)了NLC在4 周常溫儲(chǔ)存過(guò)程中的粒徑、電位和包封率的變化規(guī)律，探究了蜂蠟在脂相中的比例對(duì)NLC儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。由圖2可知，NLC0在前3 周常溫儲(chǔ)存過(guò)程中粒徑、Zeta電位和姜黃素包封率沒(méi)有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），但第4周其粒徑和姜黃素包封率顯著下降（P＜0.05）。值得注意的是，NLC5和NLC10在4 周常溫儲(chǔ)存過(guò)程中粒徑、電位和姜黃素包封率穩(wěn)定，表明和液體油組相比，添加固體脂質(zhì)（蜂蠟）可提高納米脂質(zhì)載體儲(chǔ)存穩(wěn)定性，這可能是蜂蠟的加入提高了乳液體系的剛性和黏度，脂質(zhì)相的無(wú)序晶型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，液滴不易發(fā)生聚結(jié)[26]。相比于納米乳液（NLC0），蜂蠟基NLC在室溫儲(chǔ)存過(guò)程中物理穩(wěn)定性更強(qiáng)。

圖2 蜂蠟含量對(duì)NLCs在4周內(nèi)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性影響Fig. 2 Effects of beeswax content on the storage stability of NLCs within four weeks

2.3 蜂蠟含量對(duì)NLC黏度的影響

表觀黏度是影響NLC穩(wěn)定性的關(guān)鍵參數(shù)[27]，因此本實(shí)驗(yàn)在0～100 s－1的剪切速率變化范圍內(nèi)，監(jiān)測(cè)了NLC在剪切作用下表觀黏度的變化。由圖3A、B可知，在0～0.5 s－1剪切速率內(nèi)，NLC5和NLC10的表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，繼而緩慢下降，而后趨于穩(wěn)定，表明NLC5和NLC10呈現(xiàn)出剪切稀化行為。值得注意的是，在初始剪切速率（0.1 s－1）下NLC0、NLC5和NLC10的表觀黏度分別為（0.036±0.001）、（10.220±1.034）Pa·s和（21.490±1.987）Pa·s（圖3C），表明蜂蠟的添加顯著提高了納米脂質(zhì)載體的表觀黏度（P＜0.01，P＜0.001），這可能是由于脂質(zhì)相中的蜂蠟形成了晶體結(jié)構(gòu)，增加了NLC的流動(dòng)阻力，從而提高了樣品的表觀黏度[24]。乳液黏度增大使得體系中液滴的運(yùn)動(dòng)速度減慢，有利于抑制液滴的絮凝或聚集[28]，這與2.2節(jié)中NLC儲(chǔ)存穩(wěn)定性的研究結(jié)果相印證。

圖3 蜂蠟含量對(duì)NLCs表觀黏度的影響Fig. 3 Effect of beeswax content on apparent viscosity of NLCs

2.4 蜂蠟含量對(duì)NLC小腸黏附滲透特性的影響

小腸是營(yíng)養(yǎng)活性物的主要吸收?qǐng)鏊?，因此，探究NLC在腸道的黏附滲透特性非常必要。在本研究中，采用離體小鼠小腸模型[29]測(cè)定了游離姜黃素（CON空白對(duì)照組）、負(fù)載姜黃素的NLC0、NLC5和NLC10在小腸的黏附滲透效率。由圖4A可知，CON組小鼠小腸組織未檢測(cè)到姜黃素?zé)晒庑盘?hào)，表明游離姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率很低。負(fù)載姜黃素的NLC0、NLC5和NLC10組小鼠小腸組織均檢測(cè)到強(qiáng)烈的姜黃素?zé)晒庑盘?hào)，表明NLC的引入可顯著提高姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率，這是由于NLC粒徑小，不僅增強(qiáng)了姜黃素在胃腸液中的分散性和溶解性，且增大了比表面積，增強(qiáng)了納米載體在小腸黏膜的黏蛋白中的吸附效率[30-31]；同時(shí)在小腸環(huán)境中，NLC的脂解產(chǎn)物（FFA、表面活性劑和溶解的姜黃素）和膽鹽被組裝成混合膠束和囊泡，形成的膠束和囊泡更容易通過(guò)小腸上皮靜態(tài)水層滲透到黏液底層，從而提高姜黃素在小腸上皮細(xì)胞的吸收效率[32]。由圖4B可知，NLC0、NLC5和NLC10組的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度分別為6.072×106、7.303×106和9.413×106，NLC5和NLC10組姜黃素在上皮組織細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度比NLC0組分別提高了20.27%和55.02%，表明隨著蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0%增加到10%，NLC在小腸的黏附和滲透能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），這可能是由于蜂蠟含量增大有利于提高NLC的黏度，延長(zhǎng)了NLC在黏液層的滯留時(shí)間，從而提高了可被小腸細(xì)胞吸收的姜黃素的濃度[33]。綜上，蜂蠟在脂相中的比例是調(diào)控姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率的關(guān)鍵因素，提高NLC脂質(zhì)相中的蜂蠟含量可提高其在小腸黏膜中的黏附效率，促進(jìn)其運(yùn)載的脂溶性活性物在小腸上皮組織的滲透和吸收。

圖4 蜂蠟含量對(duì)NLCs在小腸的黏附滲透特性的影響Fig. 4 Effect of beeswax content on the adhesion and penetration efficiency of NLCs in small intestine

2.5 蜂蠟含量對(duì)NLC消化釋放特性的影響

NLC在胃腸道中消化行為及其對(duì)活性物的控制性釋放是影響其遞送效率和功效發(fā)揮的關(guān)鍵因素[34]。NLC0、NLC5和NLC10在體外的釋放情況見(jiàn)圖5。在模擬胃消化結(jié)束后，3 組NLC制劑的姜黃素釋放量均小于7%（圖5A），表明NLC在胃模擬環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。相比NLC0（（6.39±0.22）%），NLC5和NLC10的姜黃素釋放量分別下降至（1.69±0.04）%和（1.58±0.03）%，表明脂質(zhì)相中蜂蠟含量增加有利于減少姜黃素在模擬胃液中的滲漏。在模擬小腸消化過(guò)程中，3 組NLC制劑的姜黃素釋放量均明顯增大，表明NLC的主要消化部位在小腸。隨著固體脂蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0增加至5%再增加至10%，姜黃素釋放總量由（99.93±0.09）%降低到（96.38±0.05）%再降低至（90.05±0.05）%，表明增加蜂蠟比例有利于降低疏水性活性物（姜黃素）的釋放總量。這可能是由于NLC蜂蠟含量增大，減少了中鏈甘油三酯與胰脂肪酶接觸面積[35]。

圖5 蜂蠟含量對(duì)模擬消化液中NLCs體外釋放行為的影響Fig. 5 Effect of beeswax content on the in vitro release profile of NLCs in simulated digestion fluid

為了進(jìn)一步探究NLC在小腸環(huán)境中的脂解過(guò)程，監(jiān)測(cè)了小腸模擬消化過(guò)程中FFA的釋放情況。如圖5B所示，與姜黃素的釋放情況類(lèi)似，在30 min內(nèi)NLC0組的FFA呈現(xiàn)出突然釋放行為，在15 min內(nèi)釋放量達(dá)到59.93%，在30 min內(nèi)釋放量大于80%。隨脂質(zhì)相蜂蠟比例的增加，NLC釋放速率減緩，30 min內(nèi)NLC5和NLC10的姜黃素釋放量?jī)H為（61.20±2.95）%和（51.30±1.03）%。對(duì)FFA釋放過(guò)程的動(dòng)態(tài)模擬可知，F(xiàn)FA釋放速率為KNLC0（0.13 min－1）＞KNLC5（0.08 min－1）＞KNLC10（0.06 min－1）（圖5C～E），進(jìn)一步證實(shí)了增加蜂蠟比例可減緩FFA釋放速率，即降低NLC脂解效率，從而降低姜黃素的釋放量。

2.6 蜂蠟含量對(duì)NLC巨噬細(xì)胞攝取的影響

巨噬細(xì)胞是炎癥發(fā)生和腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要參與者，是炎癥和腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[36]。探究巨噬細(xì)胞對(duì)不同蜂蠟含量NLC攝取效率的影響，對(duì)NLC在抗炎方面的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)作用。如圖6A、B所示，游離姜黃素組（CON）顯示出的綠色熒光信號(hào)微弱，其平均熒光強(qiáng)度為0.98×106，表明RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)游離的姜黃素?cái)z取效率低。而當(dāng)姜黃素裝載到NLC中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度提高了5.68～6.25 倍，表明NLC增強(qiáng)了小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)姜黃素的吞噬效率。NLC粒徑小、比表面積大、在血清培養(yǎng)基中的分散性和溶解性高，生物相容性高，因而有利于其被巨噬細(xì)胞吞噬和攝取[37]。值得注意的是，NLC0、NLC5和NLC10組的平均熒光強(qiáng)度分別為6.548×106、6.723×106和7.102×106，各組間不存在顯著差異（P＞0.05），表明脂質(zhì)相中蜂蠟的比例不是影響巨噬細(xì)胞吞噬NLC的關(guān)鍵參數(shù)。綜上，NLC可促進(jìn)姜黃素在巨噬細(xì)胞內(nèi)的富集，從而有利于其抗炎和抗腫瘤功效的發(fā)揮。

圖6 蜂蠟含量對(duì)NLCs巨噬細(xì)胞攝取的影響Fig. 6 Effect of beeswax content on macrophage uptake of NLCs

3 結(jié) 論

闡明脂質(zhì)相組成對(duì)NLC的消化釋放行為和巨噬細(xì)胞攝取的調(diào)控作用對(duì)于合理設(shè)計(jì)NLC以實(shí)現(xiàn)脂溶性活性物的健康效應(yīng)最大化具有科學(xué)價(jià)值。脂質(zhì)相中蜂蠟的質(zhì)量比是調(diào)控NLCs粒徑、負(fù)載率、包封率、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和剪切黏度的關(guān)鍵控制因素。蜂蠟基NLCs形貌近似球體，粒徑小（170.67～256.00 nm），具有良好的姜黃素負(fù)載率（＞1.45%）和包封率（＞87.25%）。隨著蜂蠟含量增大，其粒徑增大，負(fù)載率、包封率均有所增加。蜂蠟基NLC乳液體系的剛性和黏度增強(qiáng)，儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高。離體腸黏附滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂蠟含量是調(diào)控姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率的關(guān)鍵因素，蜂蠟含量增加可提高姜黃素小腸黏膜黏附效率，促進(jìn)姜黃素在小腸上皮組織的滲透吸收。此外，蜂蠟基NLC促進(jìn)了姜黃素在巨噬細(xì)胞內(nèi)的富集（相比游離姜黃素組，NLCs組巨噬細(xì)胞對(duì)姜黃素的攝取效率提高了5.68～6.25 倍）。體外模擬消化釋放實(shí)驗(yàn)表明，增加蜂蠟含量減緩了FFA釋放速率，繼而減少了姜黃素釋放量。綜上，本研究可為蜂蠟基NLCs在脂溶性活性物的消化控制性釋放、經(jīng)小腸黏膜增效吸收和在炎癥病灶處巨噬細(xì)胞吞噬效率的調(diào)控應(yīng)用提供理論參考。