母乳喂養(yǎng)的新生兒病理性黃疸患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)變化觀察

徐文秀，張楠，邢雪雪，葛陽(yáng)，李書(shū)瑋，畢玫榮

1 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；2 濟(jì)南市中心醫(yī)院新生兒科

新生兒黃疸是指新生兒時(shí)期由于血清膽紅素水平異常代謝使血清膽紅素升高，導(dǎo)致新生兒皮膚、鞏膜、黏膜等部位出現(xiàn)黃染的一種現(xiàn)象，可分為生理性黃疸和病理性黃疸兩種，生理性黃疸無(wú)明顯并發(fā)癥。母乳喂養(yǎng)的新生兒可能在出生后一周內(nèi)，由于生后數(shù)天內(nèi)熱卡和液體攝入不足、排便延遲等因素導(dǎo)致血清膽紅素升高。新生兒病理性黃疸又稱為新生兒非生理性高膽紅素血癥，是指各種原因?qū)е碌难迥懠t素水平異常增高或膽紅素增高性質(zhì)的改變，主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜或其他器官黃染，可伴有嗜睡、反應(yīng)差等神經(jīng)受損表現(xiàn)。生理、免疫、遺傳改變和環(huán)境因素均可能導(dǎo)致新生兒病理性黃疸［1-3］。最新研［4-8］究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)是新生兒高膽紅素血癥的致病因素之一。腸道菌群可能通過(guò)腸—肝軸的代謝途徑、免疫變化參與高膽紅素血癥的發(fā)生發(fā)展［9］。母乳喂養(yǎng)可能對(duì)新生兒早期腸道菌群結(jié)構(gòu)建立有一定的影響［8］。母乳喂養(yǎng)新生兒腸道菌群失衡和代謝物異常是否與新生兒病理性黃疸的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，目前尚不清楚。為此，我們采用高通量16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)母乳喂養(yǎng)新生兒病理黃疸患兒糞便腸道菌群，觀察其腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1 臨床資料 選取2021年11月—2022年3月濟(jì)南市中心醫(yī)院新生兒科收治的30 例新生兒病理性黃疸患兒作為觀察組，患兒的出生胎齡在38～41（39.20 ± 1.08）周，入院日齡2～5（3.27 ± 1.03）天，其中男14 例、女16例；另選擇 30例同時(shí)期本院產(chǎn)科出生的健康足月兒為對(duì)照組，出生胎齡38～41（39.13 ± 0.92）周，日齡2～5（3.33 ± 0.98）天，其中男15 例、女15 例。觀察組患兒血清總膽紅素（158.50 ± 32.47）mmol/L，直接膽紅素（16.24 ±6.39）μmol/L，間接膽紅素（143.06 ± 31.71）μmol/L。符合第九版兒科學(xué)病理性黃疸的診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］，出現(xiàn)下列任一項(xiàng)情況應(yīng)考慮病理性黃疸：①生后24時(shí)內(nèi)出現(xiàn)黃疸；②血清總膽紅素值已達(dá)到相應(yīng)日齡及相應(yīng)危險(xiǎn)因素下的光療干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)，或超過(guò)小時(shí)膽紅素風(fēng)險(xiǎn)曲線的第95 百分位數(shù)；或膽紅素每日上升超過(guò)85 μmol/L（5 mg/dL）或每小時(shí)＞0.5 m/dL；③黃疸持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，足月兒＞2周，早產(chǎn)兒＞4周；④黃疸退而復(fù)現(xiàn)；⑤血清結(jié)合膽紅素＞34 μmol/L（2 mg/dL）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入組的新生兒僅為血清膽紅素水平超過(guò)相應(yīng)日齡、相應(yīng)胎齡下藍(lán)光干預(yù)值的病理性黃疸，住院期間僅需要接受藍(lán)光照射治療。③觀察組和對(duì)照組在性別、出生日齡及體重等方面比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④所有嬰兒純母乳喂養(yǎng)，母親身體健康，無(wú)妊娠期合并癥，以排除嬰兒飲食對(duì)腸道菌群差異的影響。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他病理情況，如先天異常、出生缺陷、肝功能異常、消化道畸形、膽道及腸道疾病等的嬰兒；②服用過(guò)益生菌制劑、因感染服用過(guò)抗生素等藥物的嬰兒。本研究中所有家屬均已知情同意，并簽署知情同意協(xié)議書(shū)，同時(shí)本研究經(jīng)濟(jì)南市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批同意，倫理號(hào)為（GZR2020-001-03）。

1.2 兩組糞便標(biāo)本腸道菌群檢測(cè) 采集觀察組患兒入院后的第一次糞便，每采集一個(gè)觀察組患兒糞便，于產(chǎn)科采集同時(shí)期正常健康的足月兒糞便1次，標(biāo)本置于-80 ℃冰箱中保存。采用高通量16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)兩組新生兒糞便標(biāo)本腸道菌群：①對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行DNA 的提取（試劑盒commercial kit （Qiagen， Hilden， Germany））與質(zhì)量檢測(cè)；②目的區(qū)域PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增引物如下：PrimerF=Illumina adapter sequence 1 + CCTACGGGNGGCWGCAG；Primer R=Illumina adapter sequence 2 + GACTACHVGGGTATCTAATCC）；③檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物（瓊脂糖凝膠電泳）；④文庫(kù)構(gòu)建（Agilent 2100 Bioanalyzer）；⑤測(cè)序（illumina 2×250 bp 的雙端測(cè)序策略）；⑥質(zhì)控（TrimGalore軟件）。

1.3 兩組糞便標(biāo)本腸道菌群生物信息分析 對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括多樣性分析［操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）、β 多樣性分析］、Heatmap 分析、LEfSe 分析（展示腸道微生物群的相對(duì)豐度）、功能預(yù)測(cè)性分析（是指把組間相對(duì)豐度顯著差異的功能繪制成條形圖，預(yù)測(cè)菌群的生物學(xué)功能）。β 多樣性分析通過(guò)降維的方法來(lái)考察樣本與樣本之間的相似度和關(guān)系，種屬構(gòu)成特征。Heatmap 分析是指用顏色的深淺來(lái)顯示腸道菌群的豐度，通過(guò)顏色的梯度和相似程度反應(yīng)出腸道菌群的相似性和差異性，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。LEfSe 分析支持高維分類比較，可用于篩選最可能解釋組間差異的物種，LDA score 的絕對(duì)值＞3為兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的微生物菌群。功能預(yù)測(cè)分析使用PICRUS工具可以基于擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)其腸道菌群的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，使用Welch’sT-test篩選兩組中具有顯著差異的功能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件和R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；根據(jù)16S rRNA序列的總和來(lái)計(jì)算每個(gè)樣本的相對(duì)豐度，觀察組和對(duì)照組在目、屬、種各分類水平上的顯著差異菌群采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；采用 Pearson相關(guān)性分析法分析觀察組患兒優(yōu)勢(shì)腸道菌群與血清總膽紅素水平、直接膽紅素水平、間接膽紅素水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組糞便標(biāo)本檢測(cè)到高質(zhì)量序列有12 842 623條，平均每個(gè)樣本有324 347條。長(zhǎng)度409 bp是干凈序列的集中分布處。兩組糞便標(biāo)本檢出腸道菌群共131 個(gè)種、128 個(gè)屬、71 個(gè)科、38 個(gè)目、25 個(gè)綱、16 個(gè)門(mén)，最終得到342 個(gè)OTU。觀察組、對(duì)照組腸道菌群OTU 數(shù)分別為228、323 個(gè)，其中二者共有OTU 210個(gè)，觀察組特有OTU 18個(gè)、對(duì)照組特有OTU 113個(gè)。與對(duì)照組比較，觀察組患兒糞便腸道菌群在門(mén)、綱、目、科、屬、種各水平的細(xì)菌分類OTU 數(shù)均少（P均＜0.05）。在目水平上，觀察組、對(duì)照組芽孢桿菌的絕對(duì)豐度分別為149 135.5、4 250 701.3（Z=2.065，P=0.039）；在屬水平上，觀察組、對(duì)照組普拉梭菌的絕對(duì)豐度分別為17 400 549.9、255 143 407.6（Z=2.248，P=0.025），觀察組、對(duì)照組檸檬酸桿菌的絕對(duì)豐度分別為7246.2、0（Z=2.473，P=0.013）；在種水平上，觀察組、對(duì)照組脆弱擬桿菌的絕對(duì)豐度分別為668889.3、8760389.6（Z=2.289，P=0.022）。LEfSe分析結(jié)果顯示，觀察組影響力較大（LDA score ＞3）的腸道菌群為丁酸梭菌、鞘脂單胞菌及鞘氨單胞菌屬，對(duì)照組（LDA score ＞3）的腸道菌群有脆弱擬桿菌、毛螺菌屬。功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組患兒參與礦質(zhì)養(yǎng)分吸收、孢子形成、D-精氨酸和D-鳥(niǎo)氨酸代謝、聚酮糖單位生物合成功能通路的腸道菌群豐度更低（P均＜0.05）。

觀察組患兒芽孢桿菌與血清總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素水平均無(wú)關(guān)（r分別為-0.363、-0.195、-0.303；P均＞0.05）。觀察組患兒檸檬酸桿菌與血清總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素水平均無(wú)關(guān)（r分別為-0.029、-0.027、0.054；P均＞0.05）。觀察組患兒普拉梭菌、脆弱擬桿菌豐度與血清總膽紅素水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.727、-0.027；P均＜0.05），觀察組患兒普拉梭菌、脆弱擬桿菌豐度與血清間接膽紅素水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.730、-0.730；P均＜0.05），觀察組患兒普拉梭菌、脆弱擬桿菌豐度與血清直接膽紅素水平無(wú)關(guān)（r分別為-0.118、-0.118；P均＞0.05）。

3 討論

腸道微生物群（即腸道共生微生物）被認(rèn)為是人體的“器官”，在新生兒的病原體保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫成熟等方面發(fā)揮著重要作用。腸道微環(huán)境的改變促進(jìn)機(jī)會(huì)致病原體的生長(zhǎng)，減少共生細(xì)菌的豐度，即腸道菌群失調(diào)［11］。目前多項(xiàng)研究［6-8］結(jié)果表明，新生兒高膽紅素血癥患兒存在腸道菌群失調(diào)。在一項(xiàng)對(duì)51例新生兒黃疸的嬰兒的腸道菌群研究表明，與非新生兒黃疸嬰兒相比，新生兒黃疸嬰兒腸道微生物多樣性降低，雙菌屬下降，在門(mén)水平上厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)增加，變形菌門(mén)和梭菌門(mén)減少［6］。研究表明與健康新生兒相比，新生兒高膽紅素血癥患兒腸道微生物菌群的多樣性減少，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量減少而大腸埃希菌數(shù)量增加［7］。在對(duì)母乳黃疸新生兒腸道菌群的研究表明腸道菌群的豐富度和多樣性無(wú)顯著差異；但是腸道菌群的結(jié)構(gòu)存在差異，在門(mén)水平上，母乳黃疸組的變形桿菌含量增加，對(duì)照組中厚壁菌數(shù)量增加。在屬水平上，母乳黃疸組埃希氏菌、摩根氏菌和羅氏菌的數(shù)量減少，對(duì)照組中嗜血桿菌數(shù)量增加［8］。本研究表明，新生兒高膽紅素血癥患兒腸道菌群數(shù)量和多樣性降低，與對(duì)照組相比觀察組的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)分布存在顯著差異，在各水平細(xì)菌分類OTU 數(shù)均較少。觀察組患兒血清總膽紅素水平和間接膽紅素水平與普拉梭菌和脆弱擬桿菌呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明血清膽紅素水平與腸道菌群有一定的相關(guān)性。

本研究中芽孢桿菌目、普拉梭菌屬、脆弱擬桿菌種在對(duì)照組豐度更高。芽孢桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性桿菌，廣泛存在于人的胃腸道內(nèi)。芽孢桿菌具有抗氧化及抑制腸道內(nèi)病原菌黏附的作用。芽孢桿菌中存在的活性化合物其基本功能是抑制病原體的繁殖。芽孢桿菌中還有三種細(xì)菌素，這些細(xì)菌素可以控制腐敗和病原微生物的繁殖［12-13］。芽孢桿菌還可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增加產(chǎn)丁酸細(xì)菌如毛螺菌屬的豐度［14］。研究［15］表明地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等在治療新生兒高膽紅素血癥及母乳性黃疸中可以明顯降低血清中的膽紅素水平，縮短光療的時(shí)間，加速黃疸的消退。芽孢桿菌對(duì)新生兒黃疸的機(jī)制可能與其能改善腸道菌群失調(diào)，促進(jìn)有益菌以及抑制病原菌有關(guān)。普拉梭菌又名為普氏棲糞桿菌，屬于梭狀芽胞桿菌屬第 IV 類群，即柔嫩梭菌類群，是人體腸道內(nèi)的有益菌群，可以利用多糖產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸（SCFAs），普拉梭菌還對(duì)膽汁酸生理濃度的增加高度敏感，0.1 μg/mL 膽酸即可抑制其生長(zhǎng)［16］。許多小分子代謝產(chǎn)物是由腸道菌群和宿主共同代謝產(chǎn)生的，膽汁酸就是其中之一。腸道菌群調(diào)節(jié)膽汁酸的合成和代謝，膽汁酸影響腸道菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的內(nèi)部炎癥反應(yīng)來(lái)提高宿主的免疫功能，它們形成相互影響和調(diào)節(jié)的密切關(guān)系［17］。研究［18］表明經(jīng)人工喂養(yǎng)的新生兒高膽紅素血癥患兒在接受光療之后膽汁酸含量增加。這可能是我們研究中觀察組普拉梭菌豐度較低的原因之一。健康的腸道菌群多樣性較高。脆弱擬桿菌屬于擬桿菌門(mén)，是宿主體內(nèi)的正常定植菌，可以高效降解多糖產(chǎn)生大量SCFAs［19］。在健康嬰兒的糞便中分離出的一種脆弱擬桿菌菌株，可以通過(guò)STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)保持腸道屏障的完整性［20］。脆弱擬桿菌可以水解膽紅素，在體內(nèi)和體外條件下，能減少尿膽素原水平，包括雙氫膽紅素、中膽紅素、糞膽素原等［21］。毛螺菌屬與多種疾病有關(guān)，存在于大多數(shù)健康個(gè)體的腸道中，可能是一種潛在的有益細(xì)菌，可以參與多種碳水化合物的代謝，通過(guò)其代謝物在維持腸粘膜免疫調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡中具有重要作用，其豐度與血清IgG 水平呈正相關(guān)［22-23］。目前關(guān)于該菌的研究和證據(jù)還不是很多，還僅限于關(guān)聯(lián)性研究，在機(jī)制方面研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組豐度較高的細(xì)菌是產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要細(xì)菌。SCFAs 也稱為揮發(fā)性脂肪酸，是碳原子數(shù)小于6 的有機(jī)脂肪酸的總稱，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸及戊酸。SCFAs主要來(lái)源是結(jié)腸中厭氧菌對(duì)腸道纖維和多糖的發(fā)酵、部分氨基酸分解代謝產(chǎn)生及脂肪酸的氧化［24］。脆弱擬桿菌是乙酸、丙酸和丁酸的生產(chǎn)者，普拉梭菌可以產(chǎn)生丁酸和少量的乳酸，毛螺菌屬是乙酸和丁酸的生產(chǎn)者［16，19，22］。SCFAs如乙酸、丁酸等可以降低腸道的PH 值，當(dāng)腸道處于酸性環(huán)境時(shí)，β-葡萄糖醛酸苷酶（β-GD）的活性會(huì)降低使未結(jié)合膽紅素生成減少，有利于減輕新生兒高膽紅素血癥。SCFAs還可以通過(guò)降低腸道PH 值，促進(jìn)共生菌的生長(zhǎng)，抑制病原菌的繁殖。檸檬酸桿菌是一種致病性細(xì)菌，可以導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，SCFAs 可以增加宿主對(duì)檸檬酸桿菌感染的抵抗力。SCFAs如丁酸還可以通過(guò)促進(jìn)胃腸道肌肉的收縮和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，從而促進(jìn)腸道的蠕動(dòng)，使腸肝循環(huán)中的膽紅素排泄增多，丁酸還可以通過(guò)增加緊密蛋白的連接來(lái)維持腸壁的完整性［11，25-26，31］。李雁彬等［5］研究表明，膽紅素腦損傷組患兒腸道菌群屬水平豐度低于無(wú)膽紅素腦損傷組，梭菌、梭桿菌、琥珀酸弧菌、擬桿菌等產(chǎn)短鏈脂肪酸的細(xì)菌顯著減少，表明腸道菌群數(shù)量及多樣性的減少導(dǎo)致短鏈脂肪酸生成減少，影響腸肝循環(huán)中膽紅素的清除。

本研究中功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組在孢子形成、礦質(zhì)養(yǎng)分吸收、D-精氨酸和D-鳥(niǎo)氨酸代謝、聚酮糖單位生物合成等功能通路豐度降低。研究表明膽汁淤積的患兒腸道微生物群組成改變后其氨基酸代謝、糖代謝及膜轉(zhuǎn)運(yùn)等功能會(huì)出現(xiàn)明顯減弱［27］?？莶菅挎邨U菌的蛋白質(zhì)可以參與孢子合成與降解，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞有能力在產(chǎn)孢過(guò)程中轉(zhuǎn)化為孢子這需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的刺激，此外芽孢桿菌的抗菌化合物有兩種系統(tǒng)：非核糖體肽合成酶（NRPS）與聚酮合成酶（PKS）。PKS系統(tǒng)可以產(chǎn)生具有抗菌活性的聚酮類化合物［12-13］。腸道微生物與礦質(zhì)養(yǎng)分、氨基酸、多糖之間具有相互作用。礦質(zhì)離子對(duì)人體的健康及腸道微生物的平衡具有重要的作用，益生菌對(duì)礦質(zhì)離子吸收的促進(jìn)作用也與腸道菌群的組成和代謝有關(guān)，腸道微生物群可以通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸降低腸道PH 值從而促進(jìn)鈣離子、鎂離子等礦質(zhì)養(yǎng)分吸收，礦質(zhì)離子本身也具有提供益生元的效應(yīng)，補(bǔ)充富含鈣和鎂的海洋礦物質(zhì)混合物的膳食補(bǔ)充劑可以增強(qiáng)大鼠腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸的微生物多樣性和組成［28-30］。腸道菌群可以代謝人體內(nèi)不能消化的多糖，普拉梭菌有碳水化合物分解代謝相關(guān)的基因（如唾液酸酶基因）。脆弱擬桿菌存在高效降解多糖系統(tǒng)，其外膜囊泡（OMVs）成分有助于分解復(fù)雜的多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。毛螺菌屬也參與多種碳水化合物的代謝。攝入膳食多糖可以影響腸道菌群的平衡，多糖如膳食纖維的攝入可以增加腸道中擬桿菌的數(shù)目［28，16］。補(bǔ)充精氨酸還可以通過(guò)細(xì)胞因子和腸道菌群促進(jìn)小鼠腸道SIgA 分泌，氨基酸攝入增多及膳食纖維等多糖的缺乏會(huì)促進(jìn)檸檬酸桿菌的增殖［31］。這提示腸道菌群組成發(fā)生改變會(huì)導(dǎo)致腸道菌群的代謝功能出現(xiàn)變化。這種功能通路的改變具體引起體內(nèi)哪種物質(zhì)的改變，我們后續(xù)可以通過(guò)結(jié)合代謝組學(xué)進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，母乳喂養(yǎng)的新生兒病理性黃疸患兒與正常健康嬰兒腸道菌群存在差異，患兒腸道菌群以普拉梭菌、脆弱擬桿菌為主，主要生物學(xué)功能為聚酮糖單位生物合成、D-精氨酸和D-鳥(niǎo)氨酸代謝及孢子形成等。腸道菌群可能通過(guò)影響腸道某些代謝通路如氨基酸代謝、糖代謝、礦質(zhì)成分的吸收，影響母乳喂養(yǎng)新生兒膽紅素的清除。