吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌組織中表達及其對人肝癌細胞系鐵死亡的調(diào)控作用觀察

張玉衡，陳鳴，曹科，王剛，朱章華，虞文魁

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院重癥醫(yī)學科，南京 210009

肝癌是世界第六大常見的惡性腫瘤。單獨應(yīng)用靶向藥物治療晚期肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma， HCC）的效果不佳，部分患者在治療后發(fā)生耐藥［1-2］。因此，探索HCC 的細胞耐藥機制是目前的研究重點與難點。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式，主要表現(xiàn)為鐵催化的脂質(zhì)過氧化物對細胞各類膜結(jié)構(gòu)的破壞，被以還原性谷胱甘肽（Glutathione， GSH）-谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase 4， GPX4）為主的抗氧化系統(tǒng)負性調(diào)控［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，索拉非尼等靶向藥物在誘導(dǎo)HCC 腫瘤細胞凋亡、抑制血管新生的同時，還可抑制腫瘤細胞脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生、上調(diào)抗抗氧化系統(tǒng)GSHGPX4 的活性，抑制HCC 細胞鐵死亡，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥。吡咯啉-5-羧酸合成酶（Pyrroline-5-carboxylate synthase， P5CS）是催化脯氨酸合成的限速酶之一，除催化合成作用外還能維持細胞內(nèi)GSH 含量，從而保護腫瘤細胞免受氧化應(yīng)激損傷，具有潛在的抗氧化作用［5］。P5CS 可通過增加脯氨酸的合成，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體作用機制尚不明確［6］。P5CS 是否通過調(diào)控肝癌細胞的鐵死亡影響細胞耐藥，目前相關(guān)研究較少。為此，2023 年1-6 月，我們觀察了P5CS 在HCC 組織中的表達及其對人肝癌細胞系鐵死亡的調(diào)控作用，進一步探討其可能作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 HCC 癌組織及癌旁組織P5CS 檢測 2020 年9月—2021 年9 月間于南京鼓樓醫(yī)院就診的HCC 患者10 例。患者納入標準：①結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學診斷（B 超/增強CT 或MRI）和血清AFP 檢測（≥400 μg/L）臨床確診為HCC；②術(shù)前未經(jīng)放療、化療和靶向治療；③不伴有其他類型肝占位、肝內(nèi)膽管結(jié)石等。排除標準：①不愿意接受手術(shù)治療或出現(xiàn)肝內(nèi)/肝外廣泛轉(zhuǎn)移，暫無法進行手術(shù)治療；②肝功能和/或其他臟器功能出現(xiàn)嚴重不全，無法耐受手術(shù)治療；③術(shù)后病理證實為非HCC 的其他類型肝癌。10例患者均留取HCC 組織和對應(yīng)癌旁組織（≥5 cm）標本，并對標本的使用知情同意。取HCC 及癌旁組織，固定后石蠟包埋切片，Triton-X 通透組織細胞后封閉非特異性抗原，anti-P5CS 一抗孵育，4 ℃過夜。次日孵育二抗并滴加DAB 顯色劑，蘇木素復(fù)染后封片觀察。染色強度為陰性計0 分、弱陽性計1 分、陽性計2 分、強陽性計3 分；陽性染色細胞（陽性、強陽性染色強度細胞）百分比為＜25%者計1 分、26%～50%者計2 分、51%～75%者計3 分、76%～100%者計4 分；以染色強度、陽性染色細胞百分比相加為P5CS 的蛋白的相對表達量。重復(fù)測算3 次，取平均值。

1.2 P5CS 對人肝癌細胞系鐵死亡的調(diào)控作用觀察

1.2.1 細胞、試劑及儀器 人肝癌細胞系Li-7、Huh-7 購自中國科學院上海細胞庫；Huh-7 在含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Li-7 在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。siALDH18A1［乙醛脫氫酶家族18成員A1（ALDH18A1）基因可編碼P5CS 蛋白，基因序列GTTCGTTCTTGGAGCAACA］購自廣州銳博生物；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 試劑盒購自武漢賽維爾公司；qPCR所需引物購自北京擎科生物，具體序列GAPDH 基因qPCR 引物正向序列TCAAGGCTGAGAACGGGAAG、反向序列TCGCCCCACTTGATTTTGGA，ALDH18A1 基因qPCR引物正向序列GCCCTTCAACCAACATCTTCT、反向序列AGGGGTACAGTGATAAACGGG，ACSL4 基因qPCR 引物正向序列GCTATCTCCTCAGACACACCGA、反向序列AGGTGCTCCAACTCTGCCAGTA，LPCAT3 基因qPCR 引物正向序列GGAGCTGAGCCTTAACAAGTT、反向序列CAAAGCAAAGGGGTAACCCA，15-LOX 基因qPCR 引物正向序列ACC TTCCTGCTCGCCTAGTGTT、反向序列 GGCTACAGAGAATGACGTTGGC。一抗（anti-P5CS、anti-β-actin、anti-SLC7A11、anti-GPX4）及二抗（羊抗鼠、羊抗兔）購自美國Proteintech 公司；CCK8 試劑盒購自武漢賽維爾公司；細胞活性氧簇（ROS）檢測試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000?購自碧云天生物公司；C11-BODIPY染料購自美國Thermo Fisher公司；SLC7A11靶向抑制劑Erastin、GPX4 靶向抑制劑RSL-3 購自美國Selleck公司。

1.2.2 Li-7、Huh-7 細胞培養(yǎng)及siALDH18A1 轉(zhuǎn)染方法 取接種于6 孔板內(nèi)的對數(shù)生長期 Li-7、Huh-7細胞，按說明書將適量Lipo8000?和siALDH18A1 混合，室溫孵育15 min 后轉(zhuǎn)染細胞，控制siALDH18A1終濃度為50 nmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后TRIzol 提取總RNA，采用qPCR 法檢測細胞ALDH18A1 mRNA，與轉(zhuǎn)染前比較，轉(zhuǎn)染48 h 時Li-7、Huh-7 細胞中ALDH18A1 mRNA 相對表達量減少至27.10 ± 13.30、30.20 ± 3.60（P＜0.05），采用WESTERN Blotting 法檢測轉(zhuǎn)染前后Li-7、Huh-7 細胞P5CS 蛋白，轉(zhuǎn)染前Li-7、Huh-7 細胞P5CS 蛋白相對表達量分別為1.07 ± 0.23、0.65 ± 0.02，轉(zhuǎn)染后Li-7、Huh-7 細胞P5CS 蛋白相對表達量分別為0.35 ± 0.01、0.02 ±0.01，轉(zhuǎn)染前后Li-7、Huh-7細胞P5CS蛋白相對表達量比較，P均＜0.05。說明轉(zhuǎn)染siALDH18A1后，Li-7、Huh-7 細胞中P5CS 蛋白被成功抑制，可進行后續(xù)實驗。

1.2.3 轉(zhuǎn)染前后人肝癌細胞系鐵死亡程度觀察采用C11-BODIPY 熒光探針檢測轉(zhuǎn)染前、后Li-7 及Huh-7 細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量。C11-BODIPY 是一種脂溶性的熒光探針，能夠自由進入細胞并與細胞或細胞器膜結(jié)合，借助流式細胞儀可以在不破壞細胞膜完整性的情況下檢測細胞膜及細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的含量，是目前已知準確度最高的鐵死亡檢測指標之一［7］。取轉(zhuǎn)染前后的Li-7、Huh-7 細胞培養(yǎng)至匯合度80%～90%時，換液并加入5 μmol/L 的C11-BODIPY，37 ℃避光孵育20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，胰酶消化后PBS 重懸，用流式細胞儀FITC 通道測算細胞脂質(zhì)過氧化物含量，重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.4 轉(zhuǎn)染前后人肝癌細胞系脂質(zhì)過氧化物合成相關(guān)基因ACSL4、LPCAT3、LOX-15 檢測 采用qPCR 法檢測轉(zhuǎn)染前、后Li-7 及Huh-7 細胞內(nèi)ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因的mRNA，所有操作均同“1.2.2”。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.5 轉(zhuǎn)染前后人肝癌細胞系SLC7A11、GPX4 蛋白檢測 采用WESTERN Blotting 法檢測轉(zhuǎn)染抑制前、后Li-7 及Huh-7 細胞內(nèi)SLC7A11、GPX4 蛋白。收集6孔板內(nèi)Li-7及Huh-7細胞并使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h 孵育相應(yīng)一抗，4 ℃過夜，TBST 洗去膜上多余一抗，室溫孵育相應(yīng)二抗2 h，加入ECL 顯色液曝光。Image J 軟件測算SLC7A11、GPX4 蛋白灰度值，重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.6 加入Erastin 的Li-7、Huh-7 細胞鐵死亡程度觀察 Li-7、Huh-7 細胞分別轉(zhuǎn)染對照siRNA（D 組）或siALDH18A1（E 組），轉(zhuǎn)染48 h 時分別取Li-7 及Huh-7 細胞，各分為2 組，每組6 個復(fù)孔。其中E 組細胞換液后加入5 μmol/L 的Erastin，D 組換液后加入同體積的DMSO 作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用C11-BODIPY 熒光探針檢測Li-7 及Huh-7 細胞兩組脂質(zhì)過氧化物含量，所有操作均同“1.2.3”。重復(fù)檢測3次，取平均值。

1.2.7 加入RSL-3 的Li-7、Huh-7 細胞鐵死亡程度觀察 Li-7、Huh-7 細胞分別轉(zhuǎn)染對照siRNA（D 組）或siALDH18A1（E 組），48 h 時分別取Li-7 及Huh-7細胞，各分為2組，每組6個復(fù)孔。抑制前、抑制后的R組細胞換液后加入5 μmol/L的RSL-3，D組換液后加入同體積的DMSO 作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用C11-BODIPY 熒光探針檢測Li-7 及Huh-7 細胞兩組脂質(zhì)過氧化物含量，所有操作均同“1.2.3”，采用CCK-8 試劑盒檢測細胞活性，重復(fù)檢測3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Graphpad Prsim 8.0軟件繪圖。計量資料通過Shapiro-Wilk 進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的以-x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，不同處理組內(nèi)、組間比較采用兩因素方差分析；方差分析前檢驗方差齊性，方差不齊者進行秩變換后具備方差齊性，再進行方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 及癌旁組織P5CS 蛋白相對表達量比較 HCC 及癌旁組織P5CS 蛋白相對表達量分別為6.80 ± 2.10、0.40 ± 0.20，二者比較，P＜0.05。

2.2 P5CS對人肝癌細胞系鐵死亡的調(diào)控作用

2.2.1 轉(zhuǎn)染前、后Li-7 及Huh-7 細胞脂質(zhì)過氧化物含量比較 轉(zhuǎn)染前Li-7 及Huh-7 細胞脂質(zhì)過氧化物含量分別為1.00 ± 0.01、1.00 ± 0.02，轉(zhuǎn)染后Li-7及Huh-7 細胞脂質(zhì)過氧化物含量分別為1.05 ±0.03、0.95 ± 0.03，二者比較，P均＞0.05。

2.2.2 轉(zhuǎn)染前、后Li-7 及Huh-7 細胞ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因相對表達量比較 轉(zhuǎn)染后Li-7細胞ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因相對表達量分別為轉(zhuǎn)染前的74.00 ± 6.10、30.60 ± 29.70、31.30 ±9.50，轉(zhuǎn)染后Huh-7 細胞的三種基因相對表達量分別為轉(zhuǎn)染前的53.50 ± 11.10、31.90 ± 7.50、72.00 ± 12.70。與轉(zhuǎn)染前比較，轉(zhuǎn)染后Li-7 及Huh-7 組細胞三種脂質(zhì)過氧化物合成基因相對表達量間比較，P均＞0.05。

2.2.3 轉(zhuǎn)染前后Li-7 細胞SLC7A11、GPX4 蛋白相對表達量比較 轉(zhuǎn)染前、后Li-7 細胞SLC7A11 蛋白相對表達量分別為0.48 ± 0.07、0.17 ± 0.01，二者比較，P＜0.05；轉(zhuǎn)染后Li-7 細胞GPX4 蛋白相對表達量分別為00.29 ± 0.01、0.05 ± 0.01，二者比較，P＜0.05。

2.2.4 轉(zhuǎn)染前后加入Erastin 的Li-7、Huh-7 細胞脂質(zhì)過氧化物含量比較 加入Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡后，轉(zhuǎn)染前Li-7 E 組、Huh-7 E 組細胞脂質(zhì)過氧化物含量分別為1.03 ± 0.01、1.03 ± 0.01；轉(zhuǎn)染后Li-7 E 組、Huh-7 E 組細胞脂質(zhì)過氧化物含量分別為1.15 ±0.03、1.17 ± 0.02。與轉(zhuǎn)染前比較，轉(zhuǎn)染后Li-7 E組、 Huh-7 E 組細胞脂質(zhì)過氧化物含量升高（P均＜0.05）。

2.2.5 轉(zhuǎn)染前后加入Erastin和RSL-3的Li-7、Huh-7細胞脂質(zhì)過氧化物含量及細胞活性比較 轉(zhuǎn)染前Li-7 E 組、Li-7 R 組、Huh-7 E 組、Huh-7 R 組細胞脂質(zhì)過氧化物含量分別為1.27 ± 0.01、1.05 ±0.02、1.23 ± 0.01、1.16 ± 0.03；轉(zhuǎn)染后Li-7 E組、Li-7 R 組、Huh-7 E 組、Huh-7 R 組細胞脂質(zhì)過氧化物含量分別為1.31 ± 0.02、1.21 ± 0.02、1.29 ±0.01、1.23 ± 0.02。與轉(zhuǎn)染前比較，轉(zhuǎn)染后Li-7 E組、 Li-7 R 組、Huh-7 E 組、Huh-7 R 組細胞脂質(zhì)過氧化物含量高（P均＜0.05）。轉(zhuǎn)染后Li-7 R 組、Huh-7R 組細胞相對活性分別為78.04% ± 1.79%，81.16% ± 0.40%，Li-7 E 組、Huh-7 E 組細胞相對活性分別為89.22% ± 1.68%，87.14% ± 2.51%，R 組和E組比較，P均＜0.05。

3 討論

以索拉非尼為代表的肝癌靶向藥物理論上具有抗血管生成、抑制細胞增殖以及誘導(dǎo)凋亡的多重抗腫瘤作用，但臨床上索拉非尼或同類藥物僅針對部分基因型突變患者有效，其中相當一部分患者在用藥后不同時間還出現(xiàn)了腫瘤耐藥，總體生存期延長有限［8］。對索拉非尼作用機制的進一步探索發(fā)現(xiàn)，類似藥物可以通過p62-Keap1/NRF2 途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞合成較多的GSH，同時抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的蓄積，避免出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)的細胞鐵死亡尋找并明確調(diào)控HCC 細胞氧化-抗氧化平衡的內(nèi)在因素，對于揭示肝癌耐藥的相關(guān)分子機制具有重要意義［9］。

以脯氨酸及其代謝酶為核心的代謝途徑是近年來新發(fā)現(xiàn)的哺乳動物細胞抗氧化機制［8］。P5CS 是線粒體內(nèi)合成脯氨酸的關(guān)鍵酶之一，作為谷氨酸合成脯氨酸的第一個催化酶，由ALDH18A1 基因編碼，能夠?qū)⒐劝彼徂D(zhuǎn)化為P5C，為脯氨酸提供核心結(jié)構(gòu)——吡咯啉環(huán)；其催化活性依賴于ATP 和NAD（P）H［7］。乳腺癌細胞中P5CS 在癌基因c-MYC 的調(diào)控下含量升高并促進癌細胞增殖；敲除P5CS的編碼基因ALDH18A1 會導(dǎo)致細胞線粒體呼吸鏈受損，降低細胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力，表明P5CS具有潛在的抗氧化作用，并且都與腫瘤細胞中更多的還原當量相關(guān)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織和正常肝細胞，HCC 組織中和細胞中P5CS 含量均顯著升高，提示P5CS 在HCC 進程中可能具有潛在的促癌作用。

鐵死亡是一種以脂質(zhì)過氧化物累積導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)氧化損傷的細胞死亡方式，現(xiàn)有研究認為，鐵死亡的始動環(huán)節(jié)為鐵離子催化下的脂質(zhì)過氧化物過量合成，同時細胞內(nèi)抗氧化作用相對不足，導(dǎo)致累積的脂質(zhì)過氧化物破壞細胞膜結(jié)構(gòu)［3］?？梢?，鐵死亡強調(diào)細胞整體的氧化-抗氧化平衡狀態(tài)；抑制以GSHGPX4 為核心的抗氧化作用，能夠顯著降低細胞抗氧化能力，使細胞趨向于鐵死亡［10］。研究［9，11］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌和HCC 中P5CS 含量異常升高，而且抑制其基因ALDH18A1 表達后腫瘤細胞均出現(xiàn)了增殖減慢、下游癌基因表達降低。我們進一步分析了P5CS 與肝癌細胞鐵死亡的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)抑制P5CS沒有顯著影響細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量；然而在使用小分子抑制劑Erastin誘導(dǎo)鐵死亡后，缺少P5CS的肝癌細胞明顯出現(xiàn)鐵死亡趨勢。由于Erastin 具有誘導(dǎo)鐵死亡的特性，某種意義上也具有抗腫瘤效應(yīng)，因此，上述結(jié)果提示P5CS的存在可能保護了肝癌細胞免于藥物誘導(dǎo)的鐵死亡，賦予了HCC 腫瘤耐藥能力。這也是國內(nèi)外首次將脯氨酸代謝與腫瘤鐵死亡聯(lián)系起來。

脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生增多和細胞抗氧化作用的缺失是出現(xiàn)鐵死亡的兩個核心機制，我們進一步探索了P5CS 與以上兩種機制的相關(guān)性。細胞內(nèi)乙酰輔酶A 在乙酰輔酶A 羧化酶的作用下合成多不飽和脂肪酸（PUFA），游離PUFA 經(jīng)ACSL4 和LPCAT3 兩步催化結(jié)合磷脂（PL），形成PUFA-PL 并參與構(gòu)成膜脂質(zhì)雙分子層。然而，PUFA 具有易于過氧化的特點，因此當細胞內(nèi)LOX-15 增多時，PUFAPL 就會被過氧化為含有過氧自由基的PUFA-PLOOH，對細胞各類膜結(jié)構(gòu)造成氧化損傷［3］。因此，ACSL4、LPCAT3 和LOX-15 通常被認為是鐵死亡中調(diào)控脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因。除了以上脂質(zhì)過氧化物的異常產(chǎn)生外，以SLC7A11-GSH-GPX4 為核心的抗氧化功能缺失同樣是鐵死亡的特征［12］。合成GSH 所需三種底物氨基酸之一的半胱氨酸，主要由通道蛋白SLC7A11 逆向轉(zhuǎn)運進入細胞；進一步合成的GSH 在GPX4 催化下氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），同時為細胞提供抗氧化當量。因此，SLC7A11 的逆向轉(zhuǎn)運功能、GSH 的合成以及GPX4的催化功能是細胞抵抗鐵死亡的最主要因素［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制P5CS 并不能影響肝癌細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化關(guān)鍵基因ACSL4、LPCAT3 和LOX-15 的表達，但能顯著降低SLC7A11 及GPX4 的蛋白含量，表明P5CS 并不能影響鐵死亡的起始過程，而是通過增強抗氧化能力抑制了細胞鐵死亡。為了進一步明確P5CS 發(fā)揮抗氧化能力的靶點，我們對比了使用Erastin 或RSL-3 后，肝癌細胞鐵死亡的情況。結(jié)果顯示，兩種鐵死亡誘導(dǎo)劑均能誘導(dǎo)缺乏P5CS的肝癌細胞鐵死亡，但使用RSL-3 后細胞活性降低更為顯著、細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物蓄積更為明顯，表明P5CS 主要通過維持GPX4 含量阻止了肝癌細胞鐵死亡。

綜上所述，相比于癌旁組織，HCC 組織中P5CS表達升高。P5CS 可抑制Li-7 及Huh-7 細胞的鐵死亡，其機制可能為P5CS 抑制細胞內(nèi)GPX4 表達，促進肝癌細胞的鐵死亡。