NCAPG 促進(jìn)成骨肉瘤細(xì)胞增殖的研究

史君，陳坤峰，李桂石，趙志堅

（1.商丘市第一人民醫(yī)院急診創(chuàng)傷外科，商丘 476100；2.煙臺毓璜頂醫(yī)院關(guān)節(jié)矯形外科，煙臺 264000）

成骨肉瘤是一種侵襲性的原始骨間充質(zhì)腫瘤[1]，發(fā)病率在原發(fā)性骨惡性腫瘤中居于首位，早期表現(xiàn)隱匿而且早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，一直是骨科界的難題之一[2]。非染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)亞基凝聚素Ⅰ復(fù)合物亞基G（non-structural maintenance of chromosomes condensin I complex subunit G，NCAPG）是一種有絲分裂相關(guān)的染色體凝縮蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞中。NCAPG 在多種癌癥中異常表達(dá)，且通過相關(guān)分子機(jī)制與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及耐藥等過程密切相關(guān)[3-4]。以往研究發(fā)現(xiàn)，NCAPG 基因誘導(dǎo)G0/G1 細(xì)胞周期，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂[5]。在肝細(xì)胞性肝癌中，通過靶向調(diào)節(jié)NCAPG 可以抑制肝細(xì)胞性肝癌的生長和轉(zhuǎn)移[6-7]，但是NCAPG 基因在成骨肉瘤中的作用尚不可知。本研究主要探討NCAPG 基因?qū)Τ晒侨饬黾?xì)胞增殖的影響及其與成骨肉瘤臨床指標(biāo)的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象及分組 選擇商丘市第一人民醫(yī)院和煙臺毓璜頂醫(yī)院2010 年7 月—2021 年1 月收治的成骨肉瘤患者58 例。其中，男性23 例，女性35例，年齡16～25 歲。全部病例均已經(jīng)過病理證實(shí)，且具有完整的病例資料。選擇患者的成骨肉瘤組織為實(shí)驗(yàn)組，相應(yīng)配對的成骨肉瘤旁正常組織為對照組。在58 例成骨肉瘤病例中，臨床分級為Ⅰ～Ⅱ級者33例，Ⅲ級者25 例；腫瘤直徑＜5 cm 者22 例，腫瘤直徑≥5 cm 者36 例。所有患者均接受MAP 化療方案（大劑量氨甲喋呤+順鉑+阿霉素）治療，所有患者均行全面術(shù)前體檢，并進(jìn)行了原發(fā)性腫瘤手術(shù)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測 采用免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化的檢測，將腫瘤組織切成約3 mm 厚，在福爾馬林中固定24 h，后嵌入石蠟中，切片，每片厚度為4 μm，置于70℃環(huán)境下烤30 min，隨后放入二甲苯溶液浸泡30 min 進(jìn)行脫蠟，之后依次分別放入95%、85%和75%的乙醇溶液中各30 min。之后，將切片標(biāo)本在PBS 緩沖液中洗滌2 次，每次2 min。之后將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中并放入微波中加熱20 min 后提取抗原。然后，將切片置于室溫下放置2 h，并用PBS 緩沖液洗滌2 次，每次2 min。在除去多余的水分后，切片在室溫下加入H2O2后在濕箱中放置20 min，再次洗滌，滴入NCAPG 抗體（ab251864，Abcamplc，Cambridge，UK 1∶100），并在4℃環(huán)境下過夜。

次日，將切片室溫放置1 h，用磷酸鹽（PBS）緩沖液洗滌2 次，每次2 min。之后，在室溫下滴加IgG二級抗體，靜置2 h。再用PBS 緩沖液再次洗滌，滴加3，3-二氨基苯聯(lián)胺（Diaminobenzidine，DAB）（用A 液和B 液預(yù)先配制），室溫下染色約5～15 s。用水沖洗掉表面染料，然后用蘇木精溶液染細(xì)胞核5～8 s，用水沖洗約2 min。最后，用中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。

免疫組化結(jié)果判定: 2 名病理醫(yī)師雙盲狀態(tài)下，高倍鏡（400×）觀察腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯染色顆粒判為陽性細(xì)胞。染色程度評分規(guī)則：無染色，0 分；輕微染色，1 分；中等染色，2 分；強(qiáng)染色，3 分。染色細(xì)胞所占比例評分：無染色，0 分；染色面積＜25%，1 分；染色面積26%～50%，2 分；染色面積51%～75%，3 分；染色面積＞75%，4 分。最終評分為染色強(qiáng)度與染色面積的乘積，分?jǐn)?shù)≥4 為高表達(dá)，分?jǐn)?shù)＜3 為低表達(dá)。

1.2.2 試劑和儀器 抗NCAPG（ab251864，Abcam Cambridge，UK 1∶100）、山羊抗兔HRP（辣根過氧化物酶）次級抗體（ab6721，Abcam，1∶5 000 武漢proteintech 公司），IgG 二級抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。Trizol 試劑（15596026，Invitrogen，USA），β-肌動蛋白（ab179467，Abcam，1∶1 000），第一鏈cDNA 合成試劑盒（K1621，Thermo，USA），F(xiàn)ast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche，Switzerland）；本研究中涉及的儀器如下：ABI 7900HT QPCR Cycle，微板閱讀器（ThermoMultiskanGO，USA），PVDF 膜（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）。

2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 成骨肉瘤細(xì)胞MG-63（EMEM）用含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素雙抗體的EMEM 培養(yǎng)，U-2 OS 用含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素雙抗體的McCoy 的5a 改良培養(yǎng)基和1%青霉素-鏈霉素雙抗體在37℃和5%CO 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用基因法（中國上海）收集慢病毒載體（5′-CCAGAACCAGGCGAAGCTGGTGG-3′）和對照載體的shRNA。構(gòu)建了一個慢病毒質(zhì)粒pll3.7，插入shRNA 用于敲減人NCAPG。在聚烯存在的情況下，用shNCAPG 慢病毒感染MG-63（EMEM）和U-2 OS，在細(xì)胞感染慢病毒的第3 天，加入2 μg/mL 嘌呤霉素（P8230，白菌）篩選陽性細(xì)胞，始終保持藥物濃度。并將未進(jìn)行NCAPG 基因敲減的細(xì)胞為對照組（control 組），敲減NCAPG 基因作為實(shí)驗(yàn)組（shRNA 組）。

2.2 方法

2.2.1 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR） 應(yīng)用Trizol 試劑從轉(zhuǎn)染了NCAPG shRNA 的MG-63 細(xì)胞和U-2 OS 細(xì)胞中提取總RNA，用第一鏈cDNA 合成試劑盒（K1621，Thermo，Waltham，USA））合成cDNA，隨后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入試劑盒中，使用Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為94℃條件下15 s 及94℃條件下5 s 變性，60℃條件下25 s 退火，72℃條件下10 s 延展，共40 個循環(huán)。GAPDH 已經(jīng)被規(guī)范化，并使用2-ΔΔCt計算方法計算相對表達(dá)式。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 中基因的引物序列Tab 1 Primers of genes in qRT-PCR

2.2.2 Western 印跡 從MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞中提取總蛋白后，進(jìn)行蛋白定量，加上樣緩沖液，10%SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中，并在室溫下用10%的牛奶阻斷1 h。然后，將膜與抗NCAPG（ab251864，1∶100）、β-肌動蛋白（ab1794671∶1 000）在4℃過夜孵育。用TBST 緩沖液洗滌3 次后，用山羊抗兔HRP 二抗（ab6721，1∶5 000）孵育PVDF，PBS反復(fù)沖洗，然后加ECL 發(fā)光液，采用圖像分析系統(tǒng)對目的條帶進(jìn)行掃描分析，蛋白的相對表達(dá)用相對密度表示。

2.2.3 集落形成試驗(yàn) 培養(yǎng)使用6 孔板在37℃內(nèi)培養(yǎng)MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞14 d。然后在室溫下用多聚甲醛固定30 min，用0.2%晶紫染色20 min，并分別用PBS 洗滌?？寺〖?xì)胞的數(shù)量由人工計數(shù)并繪制出來。

2.2.4 細(xì)胞增殖檢測（CCK-8） 采用MTT 法確定MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞的生存能力。將細(xì)胞培養(yǎng)在6 孔板上，用shRNA-NCAPG 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h，48 h后用MTT 溶液處理3 h，用PBS 清洗2 次后，加入150 μL 二甲基硫砜（DMSO）培養(yǎng)4 h。最后使用微板閱讀器（ThermoMultiskanGO，美國）在570 nm 處測量光學(xué)密度（OD）。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad8.0 軟件（Graph－Pad 軟件，美國）進(jìn)行了統(tǒng)計分析和圖表繪制。通過Pearson 相關(guān)分析、χ2檢驗(yàn)和Spearman 相關(guān)分析NCAPG 與成骨肉瘤之間的關(guān)系。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 免疫組化檢測成骨肉瘤組織及正常組織NCAPG 蛋白的表達(dá) 與癌旁正常組織相比，成骨肉瘤中NCAPG蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常組織（圖1）。

圖1 NCAPG 在成骨肉瘤中的高表達(dá)（蘇木精染色法，100×和400×）Fig 1 The high expression of NCAPG in osteosarcoma（hematoxylin staining，100×and 400×respectively）

3.2 NCAPG 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果表明，NCAPG 的表達(dá)與臨床分期（P=0.042）和腫瘤大小（P=0.012）密切相關(guān)，見表2。

表2 58 例成骨肉瘤患者NCAPG 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（n）Tab 2 The relationship between NCAPG expression and clinicopathological features in 58 patients with osteosarcoma（n）

3.3 定量PCR 及Western 印跡檢測MG-63 和U-2 OS細(xì)胞NCAPG基因敲減后NCAPG基因及蛋白的表達(dá) 與對照組（control 組）相比，實(shí)驗(yàn)組（shRNA 組）NCAPG mRNA 表達(dá)水平明顯受到抑制（P＜0.000 1）（圖2）。

圖2 定量PCR 檢測MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞NCAPG 基因敲減后NCAPG 基因的表達(dá)Fig 2 Detection of NCAPG gene expression after NCAPG gene knockdowninMG-63andU-2OScellsbyquantitativePCR

與對照組（control 組）相比，轉(zhuǎn)染shRNA 組的NCAPG 蛋白表達(dá)明顯低于對照組（P＜0.000 1）（圖3）。

圖3 Western 印跡檢測MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞NCAPG 基因敲減后NCAPG 蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of NCAPG protein after NCAPG gene knockdown in MG-63 and U-2 OS cells by Western blotting

3.4 敲減NCAPG 基因?qū)Τ晒侨饬黾?xì)胞增殖的影響 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組（control 組）相比，實(shí)驗(yàn)組（shRNA 組）MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞的集落形成能力受到明顯抑制（圖4）。

圖4 敲減NCAPG 基因抑制成骨肉瘤MG-63 和U-2OS 細(xì)胞的增殖Fig 4 The proliferation of osteosarcoma MG-63 and U-2 OS cells inhibited by NCAPG knockdown

CCK8 檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（shRNA 組）MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞的增殖能力也較對照組（control 組）明顯下降（圖5）。

圖5 敲減NCAPG 基因抑制成骨肉瘤MG-63 和U-2 OS 細(xì)胞的增殖Fig 5 The proliferation of osteosarcoma MG-63 and U-2 OS cells inhibited by NCAPG knockdown

4 討論

成骨肉瘤由于其高死亡率和強(qiáng)侵襲性，導(dǎo)致許多成骨肉瘤患者失去了手術(shù)切除的機(jī)會[7]。腫瘤的早期診斷是確保治療效果的關(guān)鍵，但因成骨肉瘤早期缺乏特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時病情往往已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)展。延誤治療時機(jī)、早期轉(zhuǎn)移和化療耐藥等是成骨肉瘤患者生存期短、預(yù)后不佳的主要原因[8]。但是，傳統(tǒng)的治療方法，如放化療療效有限。近年來，靶向治療因其精準(zhǔn)性表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢，各種治療靶點(diǎn)也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。為了改善成骨肉瘤患者的預(yù)后，需要尋找更多的治療靶點(diǎn)。

在本研究中，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，NCAPG 基因在肉瘤組織中異常高表達(dá)。又通過對58 例成骨肉瘤患者的臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，NCAPG 基因的表達(dá)與腫瘤直徑、分期等臨床特征相關(guān)。因此，認(rèn)為NCAPG基因可以作為成骨肉瘤的治療靶點(diǎn)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，NCAPG 基因的高度表達(dá)與成骨肉瘤密切相關(guān)，這與之前的研究結(jié)果一致，認(rèn)為NCAPG 基因與上皮性卵巢癌組織、卵巢癌細(xì)胞株、前列腺癌、兒童膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[9-12]。并且NCAPG 基因的高表達(dá)與成骨肉瘤的分期和直徑有關(guān)，這也與其他研究對于肝細(xì)胞癌結(jié)論高度吻合，認(rèn)為NCAPG 基因呈現(xiàn)高表達(dá)，在癌旁組織中弱表達(dá)，且表達(dá)情況與分化程度和TNM分期密切相關(guān)[13]。

為進(jìn)一步驗(yàn)證NCAPG 基因?qū)Τ晒侨饬龅挠绊?，用NCAPG shRNA 轉(zhuǎn)染成骨肉瘤MG-63 和U-2 OS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NCAPG 基因敲減組NCAPG mRNA 表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下降，并且通過CCK-8測定和集落形成實(shí)驗(yàn)表明抑制NCAPG 基因的表達(dá)會顯著降低成骨肉瘤細(xì)胞的增殖。因此，證實(shí)了NCAPG基因可能參與了成骨肉瘤細(xì)胞的增殖。研究表明，NCAPG 基因的高表達(dá)促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如在肝細(xì)胞性肝癌中，通過靶向調(diào)節(jié)NCAPG 可以抑制肝細(xì)胞癌的增殖[5]，證實(shí)NCAPG可以作為一種新的、有前景的腫瘤治療靶點(diǎn)。

在肝細(xì)胞癌中，NCAPG 通過磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 信號通路發(fā)揮作用[12-13]。在賁門腺癌中，NCAPG 通過促進(jìn)cyclins（CDK4、CDK6 和cyclin D1）過表達(dá)和下調(diào)細(xì)胞周期抑制劑（P21 和P27），調(diào)控細(xì)胞異常凋亡[6]。但是NCAPG 促進(jìn)成骨細(xì)胞瘤進(jìn)程的機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

綜上所述，NCAPG 基因可能是促進(jìn)和介導(dǎo)成骨肉瘤進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制。在成骨肉瘤組織，NCAPG 基因的表達(dá)明顯上調(diào)，并且通過敲減NCAPG 基因，成骨肉瘤細(xì)胞的增殖速度明顯下降，因此，可以通過抑制NCAPG 基因的表達(dá)來治療成骨肉瘤改善患者預(yù)后。但本研究也存在一定局限性，單中心、小樣本弱化了這一結(jié)論，因此需要更多的體內(nèi)、體外研究進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論。