高糖誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞鈣化的初步探究

劉瑜佳 關(guān)為群

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科,福建省福州市 350000

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性多系統(tǒng)代謝疾病,影響許多器官和組織的結(jié)構(gòu)、功能和免疫應(yīng)答。通常表現(xiàn)為纖維化、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和心血管疾病等并發(fā)癥。在我國(guó),由于糖尿病的高發(fā)生率,糖尿病相關(guān)的口腔疾病包括牙周組織病變、口腔黏膜病變、牙體、牙髓組織病變等逐漸引起人們的重視。

牙髓鈣化是牙髓組織對(duì)創(chuàng)傷、齲壞及牙周病等刺激的一種反應(yīng),也是一種增齡性變化[1]。關(guān)于糖尿病與牙髓鈣化之間的關(guān)系,目前的研究很少,最近的一項(xiàng)研究報(bào)告稱,與健康人群相比,2型糖尿病患者更容易出現(xiàn)牙髓鈣化并伴有牙髓結(jié)石[2],同時(shí)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠牙髓組織中髓石的數(shù)量和大小均高于正常大鼠[3]。糖尿病患者不僅容易產(chǎn)生髓石,根尖周病變也經(jīng)常發(fā)生[4],散在的鈣化顆粒和髓石可能阻擋根管口,從而改變了髓腔內(nèi)部的解剖形態(tài),增加臨床醫(yī)生根管治療難度,為此需要采用合適的器械和方法將髓石移除以完成良好的牙髓治療。為了探索高糖是否會(huì)對(duì)人牙髓細(xì)胞鈣化產(chǎn)生影響,本實(shí)驗(yàn)將不同高濃度的葡萄糖分別作用于人牙髓細(xì)胞,觀察其對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖以及鈣化結(jié)節(jié)形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰酶、MTT均購(gòu)自Hyclone公司(美國(guó)),葡萄糖、DMSO、茜素紅購(gòu)于Sigma公司(美國(guó)),鼠抗人角蛋白抗體、鼠抗人波形蛋白抗體、DAB顯色劑購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司,十二烷基硫酸鈉購(gòu)于北京鼎國(guó)生物有限公司,倒置顯微鏡(Nikon TS-100,日本); 高速低溫離心機(jī)(Eppendorf,美國(guó));酶聯(lián)檢測(cè)儀(Biotek Power Wave,美國(guó))。

1.2 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng) 本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),獲得參與者知情同意,人牙髓組織取自于福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科因阻生或正畸需要拔除的14～20 歲新鮮健康的恒牙,拔除后置于含雙抗(100μg/ml 青霉素、100μg/ml鏈霉素)的PBS中; 無(wú)菌條件下取出牙髓組織,剪成小碎片。使用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)。將獲得的細(xì)胞懸液置于37°C、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng),每2d換液,當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)傳代,取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 人牙髓細(xì)胞(hDPCs)的組織來(lái)源鑒定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期性能穩(wěn)定、細(xì)胞單一的hDPCs,常規(guī)消化制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于 24 孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿板底 80%時(shí),行細(xì)胞波形蛋白及角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.4 細(xì)胞分組及培養(yǎng)基配制 將hDPCs分為: 對(duì)照組(5.5mmol/L組)和實(shí)驗(yàn)組(分別為15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L)。含5.5mmol/L 葡萄糖DMEM培養(yǎng)基是人牙髓細(xì)胞存活的最基本的營(yíng)養(yǎng)要素,作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。根據(jù)葡萄糖濃度(mmol/L)=葡萄糖含量(mg/L)/180(葡萄糖分子量),配制出含不同濃度葡萄糖的高糖培養(yǎng)基。

1.5 MTT法檢測(cè)hDPCs增殖活性 將hDPCs以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi),配制含5.5mmol/L(對(duì)照組)、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L的完全培養(yǎng)基,分別于培養(yǎng)1、3、5、7、10d,每天同一時(shí)間,每孔加入10μl MTT,置于37℃ 、CO2孵育箱培養(yǎng)4h后,小心吸掉上清,每孔加入100μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度(A)值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并記錄結(jié)果。

1.6 茜素紅染色檢測(cè)hDPCs形成鈣化結(jié)節(jié)能力 將hDPCs以1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板內(nèi), 培養(yǎng)28d后茜素紅染色,顯微鏡觀察并拍照。為了量化鈣的相對(duì)量,每孔加入0.5mol/L HCl和5%十二烷基硫酸鈉(SDS)37℃反應(yīng)1h。吸取200μl等量的上清液在OD 450nm處測(cè)量其吸光度值。做茜素紅標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～10mmol/L茜素紅溶解于5%SDS),上述測(cè)得的OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,即可獲得茜素紅濃度。

2 結(jié)果

2.1 hDPCs的形態(tài)及鑒定 牙髓組織塊原代培養(yǎng)1周即可見(jiàn)有hDPCs從組織塊周圍爬出(見(jiàn)圖1a),其形態(tài)為長(zhǎng)梭形或星形,細(xì)胞核圓形或橢圓形,胞體均勻、豐滿,核仁明顯,圍繞組織塊呈放射狀或漩渦狀生長(zhǎng)。傳代后的細(xì)胞以成纖維樣細(xì)胞為主,形態(tài)趨于一致(見(jiàn)圖1b)。hDPCs抗波形蛋白染色陽(yáng)性(見(jiàn)圖2a)抗角蛋白染色陰性(見(jiàn)圖2b)。

a 原代培養(yǎng)第6天 b 原代培養(yǎng)第12天

a 波形蛋白陽(yáng)性染色 b 角質(zhì)蛋白陰性染色

2.2 不同糖濃度對(duì)hDPCs增殖活性的影響 用MTT法檢測(cè)第3代hDPCs在五種不同糖濃度培養(yǎng)基條件下的增殖情況見(jiàn)表1,從結(jié)果中可以看出:不同濃度葡萄糖(5.5、15、25、35、45mmol/L)對(duì)牙髓細(xì)胞的增殖作用具有時(shí)間依賴性,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)hDPCs增殖作用逐漸增強(qiáng)。采用單因素方差分析,15mmol/L組僅在第5、7天有促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖的作用,與對(duì)照組(5.5mmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);25mmol/L組在第1、3、5、7天時(shí)有促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖的作用,與對(duì)照組(5.5mmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且這種增殖效應(yīng)在第7天時(shí)達(dá)到最高峰(P<0.001)。35mmol/L組在第10天與對(duì)照組(5.5mmol/L)相比,可明顯促進(jìn)hDPCs的增殖,與對(duì)照組(5.5mmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。45mmol/L組在第1、3、5、7、10天與對(duì)照組(5.5mmol/L)相比,均無(wú)促進(jìn)hDPCs的增殖,與對(duì)照組(5.5mmol/L)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同濃度及作用時(shí)間葡萄糖刺激下hDPCs增殖活性變化

2.3 不同濃度葡萄糖對(duì)hDPCs礦化結(jié)節(jié)形成的影響 hDPCs在培養(yǎng)至21d時(shí),即可看到兩組細(xì)胞均呈復(fù)層生長(zhǎng),并呈漩渦狀排列,在漩渦狀中心處可出現(xiàn)致密的礦化結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)中心透光性較差(見(jiàn)圖3a)。培養(yǎng)至28d時(shí),茜素紅染色可見(jiàn)兩組均有紅色的礦化結(jié)節(jié),正常對(duì)照組(5.5mmol/L)礦化結(jié)節(jié)數(shù)目少,結(jié)節(jié)較小,染色淺(見(jiàn)圖3b)。高糖組(15、25、35、45mmol/L)細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)數(shù)目較多,且結(jié)節(jié)較大,染色深并伴有許多顆粒狀的致密的鈣化小點(diǎn)(見(jiàn)圖3c～f)。

將上述礦化結(jié)節(jié)通過(guò)SDS方法進(jìn)行半定量分析,由圖4可以看出,濃度為15、25、35、45mmol/L的礦化沉積量均高于對(duì)照組,但僅有15和25mmol/L組與對(duì)照組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),尤其25mmol/L差異最為顯著(P<0.01)。

圖4 半定量檢測(cè)不同hDPCs組礦化結(jié)節(jié)情況

3 討論

近年來(lái)我國(guó)糖尿病的發(fā)病率逐年升高,與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥逐漸引起人們重視,高血糖是糖尿病的主要特征,研究顯示其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、牙周膜韌帶細(xì)胞、骨細(xì)胞等有明顯影響[5-7],參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)多采用高濃度的葡萄糖干預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,模擬糖尿病狀態(tài)下細(xì)胞的生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)采用改良組織塊法成功培養(yǎng)出人牙髓細(xì)胞,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的 hDPCs 抗波形蛋白染色陽(yáng)性,角蛋白染色陰性,提示細(xì)胞來(lái)源于中胚層,無(wú)上皮細(xì)胞混雜,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

牙髓細(xì)胞增殖是人牙體組織鈣化形成修復(fù)性牙本質(zhì)或礦化結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞以及生物基礎(chǔ)[8]。用MTT方法檢測(cè)高糖對(duì)hDPCs增殖的影響,從hDPCs增殖曲線圖中可以看出,葡萄糖在一定濃度范圍內(nèi)(5.5～25mmol/L)對(duì)hDPCs的生長(zhǎng)可以起到促進(jìn)作用,并呈濃度和時(shí)間依賴性。這可能與一定范圍內(nèi)高濃度的葡萄糖給予細(xì)胞的生長(zhǎng)提供更多的能量有關(guān),從而促進(jìn)其增殖,在第7天,15和25mmol/L組細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。隨著葡萄糖濃度的進(jìn)一步提高,35mmol/L組在培養(yǎng)7d內(nèi)與對(duì)照組相比并無(wú)明顯促進(jìn)hDPCs生長(zhǎng)的作用,從第7天起開(kāi)始才顯示促進(jìn)hDPCs生長(zhǎng),這可能開(kāi)始時(shí)由于過(guò)高濃度葡萄糖影響細(xì)胞外液滲透壓對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用,也有可能是因?yàn)檫^(guò)高濃度葡萄糖影響細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性有關(guān)[9],從而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng), Gabriella Doronzo 等人分別用5.5、15和25mmol/L濃度葡萄糖培養(yǎng)糖尿病模型的大鼠血管平滑肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖促進(jìn)大鼠平滑肌細(xì)胞的增殖,其中25mmol/L促進(jìn)細(xì)胞增殖效果最為顯著[10]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體一致,而超過(guò)一定濃度范圍的高糖則抑制hDPCs增殖,但其機(jī)制尚不完全明確,需要進(jìn)一步研究。

細(xì)胞外鈣鹽沉積是牙髓細(xì)胞具有礦化能力的最直接表現(xiàn),反映鈣鹽變化最直觀的表現(xiàn)就是礦化結(jié)節(jié)的形成[8]。通過(guò)不同條件下礦化結(jié)節(jié)大小和數(shù)量的比較,可以直觀觀察不同刺激對(duì)牙髓細(xì)胞礦化能力的影響。細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的先決條件是體外牙髓細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)的能力,而礦化的先決條件是細(xì)胞結(jié)節(jié)的三維結(jié)構(gòu)[11]。體外持續(xù)培養(yǎng)hDPCs時(shí),最初細(xì)胞以單層貼壁的方式生長(zhǎng),當(dāng)細(xì)胞不斷增殖單層匯合后可繼續(xù)生長(zhǎng),此時(shí)表現(xiàn)為復(fù)層生長(zhǎng)方式,繼而形成具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞結(jié)節(jié),隨后細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生礦化,最終形成礦化結(jié)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用茜素紅與表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)并用的方法發(fā)現(xiàn),hDPCs無(wú)論在正?；蛘吒咛菞l件培養(yǎng)下,在第28天時(shí)可形成茜素紅染色陽(yáng)性的鈣化結(jié)節(jié),這表明hDPCs在體外培養(yǎng)條件下具有合成、分泌并形成礦化細(xì)胞外基質(zhì)的能力。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高糖組(25、35、45mmol/L)細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)數(shù)目較多,且結(jié)節(jié)較大,染色深并伴有許多顆粒狀的致密的鈣化小點(diǎn);正常組(5.5mmol/L)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目少,結(jié)節(jié)較小,染色淺,這表明高糖可明顯促進(jìn)hDPCs形成鈣化結(jié)節(jié)的能力。用SDS法半定量檢測(cè)礦化物沉積含量的結(jié)果顯示,高糖組25mmol/L可以顯著促進(jìn)hDPCs鈣化結(jié)節(jié)的形成。這與Yuji Inagaki等[3]的結(jié)果一致,他們運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法觀察30周大小的糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠的牙髓組織的鈣化結(jié)節(jié)在數(shù)目和數(shù)量上都高于正常大鼠,但其機(jī)制仍不詳。另外,也有學(xué)者的研究也得出了類似的結(jié)論,發(fā)現(xiàn)高糖促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的骨向分化[12]。但是不同于Colombo和Kim的研究,他們認(rèn)為高糖抑制骨細(xì)胞和牙周膜韌帶細(xì)胞的成骨分化,抑制細(xì)胞外基質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)的形成[13-14]。這可能是因?yàn)樵诓煌难芯恐?由于細(xì)胞來(lái)源的異質(zhì)性,實(shí)驗(yàn)條件的不同以及實(shí)驗(yàn)所采用的葡萄糖刺激方式不同等因素,高糖對(duì)細(xì)胞礦化可能產(chǎn)生相反的作用。

綜上所述,一定濃度范圍內(nèi)的高糖以濃度依賴的方式促進(jìn)hDPCs的增殖及礦化。雖然目前的資料顯示高血糖影響了細(xì)胞的增殖以及礦化,但是糖尿病是非常復(fù)雜的全身系統(tǒng)疾病,體外模擬糖尿病高糖是否能完全代表糖尿病的機(jī)體狀態(tài)還未知。本實(shí)驗(yàn)擬初步探討高糖是否會(huì)對(duì)牙髓細(xì)胞鈣化產(chǎn)生影響,為解決糖尿病患者的一些臨床問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),在后續(xù)的研究中我們將進(jìn)一步研究高糖對(duì)牙髓細(xì)胞相關(guān)鈣化因子表達(dá)的影響。